Imagerie au microscope électronique à transmission de l’endocytose des vésicules synaptiques dans les neurones de l’hippocampe de souris

Résumé

Source : Villarreal, S., et. al., Mesure de l’endocytose des vésicules synaptiques dans les neurones de l’hippocampe en culture. J. Vis. Exp. (2017)

Cette vidéo montre l’analyse de l’endocytose des vésicules synaptiques dans les neurones de l’hippocampe en culture par marquage à la peroxydase de raifort et par microscopie électronique.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.

Microscopie électronique

1. Préparez une solution de stimulation à haute teneur en K⁺ avec HRP (peroxydase de raifort) sous forme de 31,5 mM de NaCl, 2 mM de CaCl₂, 90 mM de KCl, 25 mM d’HEPES (pH 7,4), 30 mM de glucose, 2 mM de MgCl₂, 0,01 mM CNQX, 0,05 mM AP5 et 5 mg/mL HRP, puis ajuster à un pH de 7,4 avec 5 M de NaOH.
   1. Stimulez la culture de neurones de l’hippocampe avec une solution de stimulation de 1,5 mL à haute teneur en K⁺ à température ambiante (appelée K⁺) en ajoutant 1,5 mL à chaque puits pendant 90 s. Au repos (R), appliquer la même concentration de 5 mg/mL HRP pendant 90 s, mais avec une solution saline normale. Pour l’échantillon de récupération, appliquer une solution de stimulation à haute teneur en K⁺ comme pour l’échantillon K⁺, puis laver et remplacer rapidement par une solution saline normale et incuber pendant 10 min.
2. Fixation et coloration
   
   1. Préparer un tampon de cacodylate de Na de 0,1 g de Na avec 21,4 g/L de cacodylate de Na à pH 7,4. Fixer les cellules avec 4 % de glutaraldéhyde dans un tampon de cacodylate de 0,1 M Na pendant au moins 1 h à température ambiante. Laver trois fois avec un tampon cacodylate de 0,1 M Na pendant 7 min chacune.
   2. Préparez une solution de diaminobenzidine (DAB), composée de 0,5 mg/mL de DAB avec 0,3 % de H₂O₂ dans du ddH₂O, et filtrez avec un filtre de 0,22 μm. Appliquer 1,5 mL de solution DAB pendant 30 min à 37 °C. Laver trois fois avec un tampon cacodylate 0,1 M Na pendant 7 min chacune.
      ATTENTION : Le DAB est un cancérogène toxique et suspecté. Veuillez utiliser des gants et des blouses de laboratoire.
      REMARQUE : L’étiquetage avec DAB se produit en raison de son oxydation par H₂O₂, catalysée par HRP. De petites augmentations des composants entraînent une augmentation du signal dans l’échantillon. L’augmentation de la concentration de HRP accélère l’effet du catalyseur. Des concentrations suffisamment importantes de H₂O₂ permettent des réactions secondaires débilitantes avec la HRP, inhibant l’effet de marquage³². Dans ce travail, les concentrations de ce système d’étiquetage ont été choisies sur la base des recherches actuellement disponibles.
   3. Incuber les neurones avec 1,5 mL d’OsO₄ dans un tampon cacodylate de 0,1 M Na pendant 1 h à 4 °C comme post-fixation. Laver trois fois avec 1,5 mL de tampon cacodylate 0,1 M Na pendant 7 min chacune.
      ATTENTION : En raison de la toxicité et de la réactivité de l’OsO₄, il est préférable dans de nombreux cas de conserver l’échantillon sur de la glace dans une hotte chimique plutôt que d’utiliser un réfrigérateur pour l’incubation.
   4. Préparez un tampon d’acétate de sodium de 0,1 M avec 13,61 g/L d’acétate de sodium et 11,43 mL/L d’acide acétique glacial à pH 5,0. Laver trois fois avec 1,5 mL de tampon d’acétate 0,1 M à pH 5,0 pendant 7 min chacune et incuber avec 1,5 mL d’acétate d’uranyle à 1 % dans un tampon d’acétate 0,1 M à pH 5,0 pendant 1 h à 4 °C. Laver trois fois avec 1,5 mL de tampon d’acétate 0,1 M pendant 7 min chacune.
      
3. Enrobage d’époxy
   
   1. Déshydratez la culture de neurones avec des lavages uniques de 1,5 ml à 50 %, 70 % et 90 % d’éthanol, pendant 7 min dans chacun, puis 3 lavages de 1,5 ml d’éthanol à 100 % pendant 7 min chacun dans une hotte.
   2. Mélangez 485 mL/L de résine époxy de bisphénol-A-(épichlorhydrine), 160 mL/L d’anhydride dodécénylsuccinique (DDSA), 340 mL/L d’anhydride méthyl-5-norbornène-2,3-dicarboxylique (NMA) et 15 mL/L de 2,4,6-tris(diméthylaminométhyl)phénol (DMP-30) pour créer la résine époxy. Mélangez bien, puis conservez sous vide pour éliminer les bulles d’air.
      REMARQUE : Il est essentiel d’éliminer les bulles d’air dans la résine, en particulier celles plus petites que visibles à l’œil nu, car elles peuvent provoquer des cavités dans la résine pendant la section.
   3. Infiltrer l’échantillon en remplaçant l’éthanol par de la résine époxy à 50 % dans de l’éthanol pendant 30 min à température ambiante sur un agitateur, puis de la résine époxy à 70 % dans de l’éthanol pendant 30 min à température ambiante sur un agitateur.
   4. Remplacez la solution de résine époxy par de la résine époxy à 100 % et laissez incuber pendant 10 min à 50 °C. Effectuez deux échanges de résine époxy fraîche à 100 % avec incubation pendant 1 h à 50 °C. Ajoutez de la résine époxy fraîche à 100 % et laissez durcir à 50 °C pendant la nuit, puis à 60 °C pendant plus de 36 h pour durcir.
4. Retirez chaque échantillon de la plaque à puits multiples à l’aide d’une scie à main de bijoutier. Sélectionner des régions d’intérêt, des concentrations denses de cellules, à l’aide d’un microscope à lumière inversée, puis découper des blocs de 70 à 80 nm pour les sectionner par microtome. Montez la zone coupée dans le mandrin du microtome et chargez le microtome. Positionnez le mandrin dans le microtome et montez un couteau diamanté avec le bord parallèle à la surface du bloc. Collectez des sections de 70 à 80 nm d’épaisseur directement sur des grilles individuelles.
5. Dissoudre l’acétate d’uranyle dans l’eau pour une solution à 1 % en poids, et dissoudre séparément le citrate de plomb dans l’eau pour une solution à 3 % en poids. Contre-colorer les sections par immersion avec de l’acétate d’uranyle aqueux à 1 % pendant 15 min puis du citrate de plomb aqueux à 3 % pendant 5 min pour améliorer le contraste des échantillons.
6. Imagerie EM
   1. Examinez les coupes avec un microscope électronique à transmission et enregistrez des images avec une caméra numérique CCD à un grossissement primaire de 10 000 à 20 000X.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Neurobasal medium	Thermo Fisher	21103-049	milieu de croissance pour neurone, réchauffer jusqu’à 37°C avant utilisation
B27	Thermo Fisher	17504-044	Gradient pour la différenciation neuronale
Glutamax	Thermo Fisher	35050-061	Gradient for neuronal culture
Trypsin XI de pancre bovin	Sigma	T1005	Tissus
Déoxyribonucléase I du pancréas bovin	Sigma	D5025	Neuronal culture-inhibiteurs de la suspension
Poly-l-lysine	Sigma	P4832	Microscopie électronique, substrat pour la croissance neuronale, appliquer sur une plaque multipuits pendant 1 h à température ambiante puis laver à l’eau stérilisée 3 fois
Horseradish peroxidase(HRP)	Sigma	P6782	Microscopie électronique, marquage des vésicules synaptiques endocytosées par catalyse du DAB en présence de peroxyde d’hydrogène, la concentration finale est de 5 mg/mL dans une solution saline normale, faire frais avant utilisation
Sodium cacodylate	Electron Microscopy Sciences	12300	Microscopie électronique, tampon pour fixateurs et lavage, la concentration finale est de 0.1 N
3,3′-Diaminobenzidine(DAB)	Sigma	D8001	Microscopie électronique, marquage des vésicules synaptiques endocytosées, substrat pour HRP, la concentration finale est de 0,5 mg/mL en DDW et filtrée, faire frais avant utilisation
Hydrogène peroxyde solution	Sigma	H1009	Microscopie électronique, marquage des vésicules synaptiques endocytosées en induisant une réaction HRP-DAB, la concentration finale est de 0,3 % en DDW, faire frais avant utilisation
Glutaraldehyde	Electron Microscopy Sciences	16365	Microscopie électronique, fixateurs, la concentration finale est de 4 % dans le tampon Na-cacodylate, préparer avant utilisation, bien agiter avant de l’utiliser
TEM	JEOL	200CX	Microscopie électronique, imagerie des vésicules endocytosées et modifications
appareil photo numérique CCD	AMT	XR-100	Microscopie électronique, capture d’images
Citrate de plomb	Leica microsystems	16707235	Microscopie électronique, coloration de grille

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