Imagerie par bioluminescence de la neuroinflammation chez une souris transgénique

Résumé

Source : Breid, S., et. al. Imagerie par bioluminescence de la neuroinflammation chez les souris transgéniques après inoculation périphérique de fibrilles d’alpha-synucléine. J. Vis. Exp. (2017)

Cette vidéo démontre l’imagerie par bioluminescence de la neuroinflammation chez les souris transgéniques, mettant en évidence les réactions luciférase-luciférine dans les astrocytes activés. Le protocole permet une quantification non invasive de l’activation astrocytaire, ce qui facilite les études sur l’inflammation du SNC et l’efficacité thérapeutique.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

Modèle animal

1. Intercroisez des souris hémizygotes Tg(Gfap-luc+/-) avec des souris hémizygotes Tg(M83+/-) pour générer des souris hémizygotes bigéniques Tg(M83+/- :Gfap-luc+/-).
2. Génotypez la descendance avec la PCR en temps réel pour la présence du transgène codant pour l’alpha-synucléine humaine et avec la PCR standard pour la luciférase de luciole.
3. Inoculer les animaux à l’âge de six à huit semaines.

Préparation de l’inoculum

1. Préparer de l’alpha-synucléine humaine recombinante monomère avec la mutation A53T dans un tampon salin tamponné Tris (TBS) contenant 150 mM de NaCl dans 20 mM de Tris-HCl (pH 7,2).
2. Préparez l’alpha-synucléine fibrillaire pour les inoculations en agitant 3 μg/μL d’alpha-synucléine humaine recombinante monomère dans un agitateur orbitaire à 800 tr/min et 37 °C pendant 5 jours.
3. Diluer les assemblages de fibrilles dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pour atteindre une concentration finale de 1 μg/μL pour les inoculations intrapéritonéales.
4. Fragmentez les fibrilles d’alpha-synucléine à l’aide d’un sonicateur à bâtonnets pendant 1 min (40 impulsions d’une durée de 0,5 s avec une pause d’une seconde entre chaque impulsion et une amplitude réglée à 50 %) sur de la glace. Pour éviter la contamination par ensemencement croisé. Utilisez des sondes de sonication propres pour préparer différents inoculums.

Injections intrapéritonéales

1. Pour les injections intrapéritonéales, narcotiser brièvement les animaux dans une chambre d’anesthésie par inhalation avec de l’isoflurane/oxygène en utilisant un débit de 2 L/min et le vaporisateur réglé à 2 %. Pincez l’orteil de l’animal et confirmez qu’il ne retire pas son membre postérieur pour assurer une bonne anesthésie.
2. Remplissez une seringue hypodermique jetable de 27 g avec 50 μL de fibrilles d’alpha-synucléine soniquées ou de PBS.
3. Injecter directement dans le péritoine de la souris et éviter de pénétrer dans l’intestin grêle ou le caïcum situé derrière la paroi abdominale en tenant l’animal en position dorsale, la tête tournée vers l’arrière de l’investigateur et vers le bas à environ 45°. Surveiller les animaux jusqu’à ce qu’ils se soient remis de l’anesthésie.

Imagerie par bioluminescence

1. Image Tg(M83+/- :Gfap-luc+/-) toutes les 2 à 4 semaines à l’aide d’un système d’imagerie par bioluminescence.
2. Avant l’imagerie, anesthésier brièvement les souris dans une chambre à isoflurane/oxygène avec un débit de 2 L/min et le vaporisateur réglé à 2 %. Pincez l’orteil de l’animal et confirmez qu’il ne retire pas son membre postérieur pour assurer une bonne anesthésie.
3. Rasez et épilez la tête des souris avec une crème dépilatoire. Colorez les oreilles en noir avec un marqueur non irritant pour bloquer la bioluminescence non spécifique.
4. Diluer le sel de potassium de D-luciférine, le substrat de la luciférase, dans du PBS dans une solution mère de 30 mg/mL. Conservez-le dans des aliquotes de 1 mL à -20 °C. Protégez la D-luciférine dissoute de l’exposition à la lumière.
5. Peser les animaux avant l’injection. Calculer le volume exact de D-luciférine pour l’injection de 150 mg/kg de poids corporel. Injectez par voie intrapéritonéale de la D-luciférine et renvoyez l’animal dans la chambre d’anesthésie.
6. Démarrez le logiciel d’imagerie. Une fois que le système d’imagerie a atteint sa température de fonctionnement, initialisez-le en cliquant sur le bouton « Initialiser » dans le panneau de configuration.
7. Sélectionnez les boutons 'Luminescent' et 'Photographie'. Réglez le temps d’exposition sur 60 s, le binning sur « Moyen », le F/Stop sur « 1 » et le gain EM sur « Off ».
8. Vérifiez que le filtre d’excitation est réglé sur 'Bloquer' et le filtre d’émission sur 'Ouvert', et réglez la hauteur du sujet sur 1,50 cm.
9. Dix minutes après l’injection de D-luciférine, placez les animaux sur la plaque chauffante de la chambre d’imagerie et assurez-vous que leur museau est correctement placé dans la sortie d’anesthésie. Fermer le débit isoflurane/oxygène de la chambre d’inhalation et ouvrir le débit de la chambre d’imagerie avec un débit de 0,25 L/min et une évaporation de 2 %. Fermez correctement la porte de la chambre d’imagerie.
10. Cliquez sur le bouton 'Acquérir' pour mesurer la bioluminescence, ce qui prend 60 s.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Seringue de calibre 27	VWR	613-4900
Isoflurane	Piramal Healthcare	PZN 4831850
Crème dépilatoire	Veet
Secureline lab marker	Neolab	25040
D-luciferin potassium salt	Acris	LK10000	30 mg/mL solution
Thermomixer	Eppendorf	5776671
Sonopuls Mini20 sonicator	Bandelin	3648
Système d’imagerie IVIS Lumina II	PerkinElmer
Living Image 3.0 Software	PerkinElmer
Tg(M83+/-) souris ou B6 ; C3-Tg(Prnp-SNCA*A53T)83Vle/J mice	Le Laboratoire Jackson	4479

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