Marquage rétrograde des motoneurones de la drosophile à l’aide de colorants lipophiles fluorescents

Résumé

Source : Inal, M. A. et. al., Tracé rétrograde de Drosophila Motoneurones embryonnaires à l’aide de colorants fluorescents lipophiles. J. Vis. Exp. (2020)

Cette vidéo montre la méthode de marquage rétrograde des motoneurones de Drosophila à l’aide de colorants lipophiles. Le colorant pénètre dans l’axone, se déplace rétrogradement et étiquette les neurones en vert, ce qui permet une visualisation détaillée de leur morphologie et de leurs projections au microscope confocal.

Protocole

1. Équipement et fournitures

1. Matériaux pour la collecte d’embryons et l’entraînement des adultes à pondre des œufs
   1. Préparez l’appareil de filtration en sectionnant un tube de 50 mL et en ouvrant un trou dans le capuchon pour installer un filtre à mailles avec des pores de 100 μm (Table des matériaux) entre le tube et le bouchon.
      REMARQUE : Alternativement, des filtres cellulaires avec des pores de 100 μm (Table des matériaux) peuvent être utilisés pour l’étape de filtration de la collecte d’embryons.
   2. Fabriquez des plaques de gélose avec le prémélange de gélose au raisin (Table des matériaux) selon les instructions indiquées. Brièvement, mélangez délicatement un sachet du mélange de poudre dans 500 ml d’eau distillée à température ambiante (RT, 23 °C) (dH₂O) et passez le mélange dissous au micro-ondes à ébullition vigoureuse. Après refroidissement à 70−75 °C, versez le mélange dans des boîtes de Pétri (60 mm). Une fois la gélose solidifiée, conservez les plaques à 4 °C.
   3. Préparez la pâte de levure en mélangeant la levure sèche active (Table des matériaux) et l’eau jusqu’à obtenir une consistance pâteuse, et maintenez à 4 °C.
   4. Utilisez des cages de collecte d’œufs (pour une boîte de Pétri de 60 mm, Table des matériaux) qui fournissent un flux d’air suffisant.
      
2. Préparation des aiguilles de dissection et des micropipettes d’injection de colorant
   1. Préparer la micropipette d’injection de colorant et l’aiguille de dissection à partir du même tube capillaire d’un diamètre intérieur de 0,6 mm et d’un diamètre extérieur de 1,2 mm (Table des matériaux). Tirez le tube capillaire à l’aide d’un extracteur de micropipette à 7 % à partir d’une sortie maximale de 170 V (Tableau des matériaux) pour créer une aiguille pointue avec un cône de ~0,4 cm de longueur.
   2. Pour l’injection de colorant, ajustez la micropipette avec une micropipette biseautée (Table des matériaux) par une technique de biseautage de bulles décrite dans le manuel de l’instrument.
      1. En bref, trempez le broyeur avec un agent mouillant (Table des matériaux) pour éviter que l’eau ne 'traîne' la pointe de l’aiguille. Placez l’aiguille sur la pince de la micropipette à 25−30° et abaissez la pointe sur les deux tiers du rayon à partir du centre de la surface biseautée. Broyez l’aiguille pendant qu’une seringue avec un tube pousse de l’air dans l’aiguille pour s’assurer que la micropipette sera exempte de copeaux de verre.
      2. Marquez la micropipette avec un marqueur permanent à pointe fine pour indiquer la position de l’ouverture au niveau de la pointe après le biseautage, car il est difficile de localiser l’ouverture étroite de la micropipette qui est formée en biais.

2. Préparation pour la collecte

1. d’embryonsAssurez-vous que les mouches adultes (20−40 Canton-S de type sauvage ou mouches blanches), mâles et femelles, sont maintenues jeunes (<7 jours) et dans des conditions saines pour une collecte idéale d’œufs.
   REMARQUE : Pour stimuler la ponte, les mouches sont entraînées dans leur cage de collecte d’œufs quelques jours avant la collecte des œufs sur des plaques de gélose striées de pâte de levure au moins une fois par jour.

3. Embryo Staging

1. Laisse les mouches pondre des œufs pendant la nuit (ou au moins 15 h) à RT pour collecter les embryons à 15 h après la ponte (AEL), c’est-à-dire au stade 16, pour voir la dendritogenèse des motoneurones de la cellule du coin antérieur (aCC) et de la crevette crue 3 (RP3). Le matin, récupérez l’assiette avec les œufs.
   NOTE : Les embryons à 15 h AEL auront un intestin distinct à 4 chambres. Pour l’imagerie, les différentes étapes suivent leurs critères morphologiques spécifiques et leurs conditions de vieillissement.
2. Pour recueillir les embryons, déchorionnez les œufs pondus sur la plaque avec 50 % d’eau de Javel pendant 5 min.
3. Une fois que les chorions se sont dégagés, versez le contenu de la plaque à travers l’appareil de filtration ou la passoire cellulaire pour isoler les embryons. À l’aide d’une bouteille d’eau compressible, diluez l’eau de Javel laissée sur la plaque et recueillez autant d’embryons que possible en transvasant le mélange dans le filtre.
4. Lavez les embryons sur le filtre 3−4x avec plus d’eau ou jusqu’à ce que l’odeur d’eau de Javel se dissipe. Retirez le filtre de l’appareil et lavez les embryons sur une autre assiette propre avec de l’eau. Décantez l’eau de la nouvelle plaque sur laquelle se trouvent les embryons.
5. Préparez une diapositive de verre en la recouvrant de deux couches de ruban adhésif vinyle au centre, formant un rectangle. Découpez une flaque rectangulaire dans le ruban à l’aide d’une lame de rasoir. Placez une fine bande de ruban adhésif double face vers l’extrémité supérieure de la piscine, c’est là que les embryons seront placés, comme le montre la figure 1.
6. À l’aide de pinces fines, sélectionnez individuellement 5−10 embryons à 15 h AEL et placez-les sur le ruban adhésif double face avec le côté dorsal vers le haut. Ajoutez du sérum physiologique d’insecte Ringer dans le bassin de dissection pour protéger les embryons de la dessiccation (figure 1).

4. Dissection and Staining

1. À l’aide d’une aiguille de verre sous un microscope de dissection (Table des matériaux), coupez la ligne médiane d’un seul embryon à sa surface, de son extrémité postérieure à son extrémité antérieure. Ensuite, faites glisser l’embryon hors de la membrane vitelline du ruban adhésif sur le verre (encadré sur la figure 1). Veillez à ne pas endommager les tissus internes de l’embryon.
2. Retournez les tissus épithéliales à partir du centre et fixez le bord de l’épiderme sur la surface de la lame de verre (Figure 1, en médaillon).
3. À l’aide d’une aiguille reliée à un tube avec une ouverture de pointe de ~300 μm (préparée en brisant la pointe fine d’une aiguille de dissection), aspirez ou soufflez de l’air pour détacher et retirer les troncs trachéaux longitudinaux dorsaux ainsi que les entrailles restantes.
4. Utilisez 4 % de paraformaldéhyde (PFA) dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pour fixer les embryons pendant 5 min à RT. Lavez les embryons 3x avec du PBS.
5. Teindre les embryons avec 1 μL d’anticorps anti-peroxydase de raifort conjugué à un colorant cyanine 3 (anti-HRP Cy3) (Table des matériaux) dans 200 μL de PBS pendant 1 h. Laver les embryons avec du PBS 3x après la coloration.
   REMARQUE : Le colorant anti-HRP peut être changé en fonction des colorants lipophiles choisis pour l’injection.

5. Remplissage de la micro-pipette d’injection

1. Chauffer des colorants lipophiles (5 mg/mL de 3,3'-dioctadécyloxacarbocyanine, perchlorate (DiO) ou 1,1′-dioctadécyl-3,3,3′,3′-tétraméthylindodicarbocyanine, sel de 4-chlorobenzènesulfonate (DiD), Table des matériaux) à 60 °C dans un mélange 1:10 d’éthanol et d’huile végétale avant utilisation.
2. Préparez une lame de colorant dissous dans l’huile pour la micropipette d’injection. Placez la micropipette dans le support capillaire (Figure 2, #1). À l’aide du micromanipulateur (Table des matériaux), ajustez la micropipette pour qu’elle soit sur la lame de colorant. Ensuite, ajustez la platine pour placer la micropipette sur le colorant (Figure 2, #2).
3. Pour remplir la micropipette, utilisez un micro-injecteur (Table des matériaux) (Figure 2, #3). Prélevez le colorant dans la micropipette en réglant le P_i (pression d’injection) entre 200 et 500 hPa (hectopascal), le T_i (temps d’injection) entre 0,1 et 0,5 s et P_c (pression de compensation) à 0 hPa pendant 5 min (Figure 2, #4).
4. Une fois le colorant collecté, retirez la lame de colorant et placez l’échantillon sur la platine du microscope. Ensuite, augmentez le Pc à une plage de 20 à 60 hPa avant d’abaisser la micropipette dans l’échantillon pour éviter la contamination du PBS par capillarité.

6. Injection de colorant dans les neurones

1. Localisez l’embryon au centre à l’aide du microscope avec lentille d’objectif 10x (Table des matériaux) et alignez la micropipette avec l’embryon.
   REMARQUE : La taille de la gouttelette de colorant peut être ajustée en changeant le Pi ou la taille de l’ouverture de la pointe de la micropipette. La gouttelette doit mesurer 10 à 20 μm, ce qui correspond à peu près à la largeur d’un muscle.
2. Changez l’objectif pour un objectif 40x à immersion dans l’eau (Table des matériaux) et immergez l’objectif dans PBS pour voir l’embryon.
   1. Utilisez la microscopie à fluorescence pour vérifier la morphologie neuronale marquée par l’anti-HRP Cy3 et déterminer le site d’injection.
   2. Pendant l’injection, utilisez la microscopie à fond clair pour voir la gouttelette de colorant. Lorsque l’embryon est focalisé, changez la position de la micropipette pour établir un contact doux avec l’extrémité de l’axone d’intérêt (par exemple, aCC, RP3).
   3. Déposez le colorant dans un hémi-segment abdominal droit (A2−A6) à la jonction neuromusculaire de aCC ou RP3 (Figure 3) avec DiD ou DiO, en utilisant les neurones marqués par l’anti-HRP Cy3. À l’aide de la commande manuelle (souris ; Figure 2, 5) libérez le colorant et retirez la micropipette après avoir déposé le colorant avec le micromanipulateur et passez au site d’injection suivant.
      REMARQUE : Contrairement à d’autres colorants (par exemple, le jaune Lucifer, la calcéine) qui se propagent dans les cellules voisines par des jonctions lacunaires, les colorants lipophiles s’associent aux membranes cellulaires et ne se transfèrent pas aux voisins. Cependant, en raison de la taille relativement grande de la gouttelette de colorant, cette technique entraîne également le marquage des muscles partenaires (Figure 3A).
3. Incuber l’échantillon à RT pendant 1 h après la chute de colorant avant l’imagerie.
   REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici avant le montage, et l’échantillon peut être conservé à 4 °C pendant la nuit. Des colorants lipophiles peuvent également être administrés par ionophorèse si un amplificateur intracellulaire à couplage direct (CC) est facilement disponible.

7. Imagerie avec un microscope

1. confocalRetirez le ruban adhésif double face et le ruban adhésif en vinyle de la lame de verre à l’aide d’une pince.
2. Préparez une lamelle (verre de couverture n° 1 de 22 x 22 mm2) avec une petite quantité de graisse sous vide (Table des matériaux) aux quatre coins et placez-la soigneusement sur l’échantillon, en évitant les bulles d’air. Retirez tout excès de PBS à l’aide d’essuie-glaces.
3. Enfoncez la lamelle pour ajuster la distance de travail entre l’objectif et l’échantillon. Scellez complètement les bords de la lamelle avec du vernis à ongles.
4. Image à un grossissement de 10x et 100x à l’aide d’un microscope confocal.

Résultats

Figure 1 : Configuration de la piscine de dissection. La chambre bleue que l’on voit sur la diapositive de verre est créée avec du ruban adhésif en vinyle qui maintient les tampons à l’intérieur. Le ruban adhésif double face r...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
10x	Nikon	<
objectif à immersion dans l’eau 40x	Nikon		NIR Apo
Tube capillaire	Frederick Haer&Co	27-31-1
Microscope confocale	Andor	N/A	Unité confocale de disque rotatif Dragonfly
Verre de couverture	Corning
DiD	ThermoFisher	V22886
DiI	ThermoFisher	V22888
DiO	ThermoFisher	V22887
Microscope de dissection	Nikon	N/A	SMZ-U
Ruban adhésif double face	Scotch	665
graisse sous vide poussé Dow corning	Fisher Sci.	14-635-5D
Dumont #5 Forceps	Outils de science fine	11252-20	<
FlyStuff	59-100
FemtoJet 5247	Eppendorf	discontinued	FemtoJet 4i (N° de catalogue 5252000021)
Micromanipulateur	Sutter	MP-225
Chanfreineuse de micropipette	Sutter	BV-10-B style='background-color :#ffffff ;padding :0px 3px ;vertical-align :bottom ;'>
Extracteur d’aiguille	Narishige	PC-100
sachets de prémélange de poudre de gélose au raisin Nutri-fly	FlyStuff	47-102
Millipore
solution de paraformaldéhyde à 16 %, grade EM	Sciences de la microscopie électronique	15710	Toutes les notes
PBS	Roche	11666789001	Vendu sur sigmaaldrich, solution en boîte 10x
Photo-Flo 200	Kodak	146 4510	Agent mouillant
Microscope à fluorescence droit	Nikon	N/A	Eclipse Ci avec une source
Ruban isolant en vinyle	Scotch	6143
VWR	10199-659
Yeast	FlyStuff	62-103	Levure sèche active (RED STAR)

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