Microscopie par immunofluorescence de cellules neurales différenciées de cellules dérivées du sang périphérique

Résumé

Source : Becker-Kojić, Z. A., et. al., Génération sans GM de cellules neuronales dérivées du sang. J. Vis. Exp. (2021)

La vidéo présente un protocole de préparation de cellules neurales dérivées de cellules sanguines périphériques reprogrammées pour la microscopie à fluorescence, mettant en évidence des types de cellules distincts et des stades de développement grâce à l’imagerie par immunofluorescence.

Protocole

1. Analyse par microscopie par immunofluorescence de cellules neurales dérivées du sang
   1. Cultivez les cellules pendant 16 jours et retirez le support.
      1. Incuber avec un fixateur préchauffé composé de 75 mL d’eau stérile, 4 g de paraformaldéhyde. Ajouter 10 N NaOH au besoin et remuer jusqu’à ce que la solution s’éclaircisse. Ajoutez ensuite 10 ml de 10x PBS, 0,5 ml de MgCl₂, 2 ml de 0,5 M EGTA et 4 g de saccharose. Titrer à pH 7,4 avec 6 N HCl et porter à 100 mL d’eau stérile pendant 15 min.
      2. Jetez le fixateur et lavez les cellules 3 fois pendant 5 min à chaque fois. Ajoutez immédiatement une solution Triton X à 0,3 % fraîchement préparée et perméabilisez les cellules pendant 5 min. Laver 3 fois avec du PBS et ajouter une solution bloquante à base de PBS et 5 % de BSA.
      3. Bloque les cellules à température ambiante sur une plaque à bascule pendant 1 heure.
      4. Préparez des dilutions appropriées d’anticorps dans 1 % de BSA/PBS et incubez les cellules avec des dilutions d’anticorps sur une plaque à bascule pendant 1,5 h à température ambiante. Lavez les cellules 3 fois avec du PBS pendant 5 minutes chacune, incubez les cellules avec du DAPI et montez les lamelles avec un support de montage pour une visualisation au microscope.
         REMARQUE : Les anticorps directement marqués utilisés dans cette expérience sont listés dans la Table des Matériaux.

Matériaux