Analyse des structures amyloïdes dans une coupe de tissu à l’aide de la microscopie d’imagerie à durée de vie de fluorescence

Résumé

Source : Nyström, S., et al., Imagerie des tissus amyloïdes colorés avec des oligothiophènes conjugués luminescents par microscopie confocale hyperspectrale et imagerie à vie de fluorescence. J. Vis. Exp. (2017).

Cette vidéo montre l’analyse des structures amyloïdes à l’aide de la microscopie d’imagerie à vie de fluorescence ou FLIM, en utilisant un colorant hFTAA pour révéler des noyaux compacts bleu/vert et des périphéries instables rouge/jaune dans des images codées en couleur, reflétant l’organisation de l’amyloïde.

Protocole

1. Préparation d’échantillons de tissus

REMARQUE : De nombreux types de tissus peuvent être imagés en utilisant l’acide heptamère-formyl thiophène acétique (hFTAA) comme marqueur amyloïde. La ZLEA est sensible à la conformation des agrégats. La coloration doit donc de préférence être effectuée sur des agrégats non perturbés sans exposition aux épitopes. Une qualité spectrale optimale est obtenue si la fixation des tissus est réduite au minimum. Par conséquent, il est préférable d’utiliser des matériaux frais congelés, délicatement fixés dans de l’éthanol au moment de la coloration. Cependant, il est également possible de détecter des dépôts amyloïdes dans les tissus qui ont été fixés avec , par exemple , formol. La ZLEhF pénètre généralement bien dans les tissus. Sélectionnez une épaisseur d’échantillon compatible avec la technique d’imagerie prévue.

1. Si des sections fixées au formol et incluses dans de la paraffine sont utilisées, elles doivent être déparaffinisées dans du xylène pendant la nuit. Ensuite, trempez les sections dans des bains consécutifs d’éthanol à 99 %, d’éthanol à 70 %, de dH₂O et de solution saline tamponnée au phosphate (PBS), 10 min dans chacun. Laissez les sections de tissu sécher dans des conditions ambiantes.
   Attention : Le xylène est toujours manipulé dans une hotte chimique. Le xylène et d’autres solvants organiques sont nocifs.
   1. Décongeler les cryosections à température ambiante. Fixez les sections de tissu dans du formol à 10 % pendant la nuit et réhydratez-les en les trempant dans des bains consécutifs d’éthanol à 99 %, d’éthanol à 70 %, de dH₂O et de PBS, 10 min dans chacun. Laissez les sections de tissu sécher dans des conditions ambiantes.
2. Ajoutez des gouttelettes de la solution de travail hFTAA (environ 200 μL) aux coupes de tissu pour la couvrir. La gouttelette doit rester en place par tension superficielle. Incuber pendant 30 min à température ambiante pour la coloration.
3. Rincez la solution de coloration avec 500 μL de PBS à l’aide d’une pipette, puis plongez la lame dans le bain de PBS pendant 10 min. Laissez la section sécher dans des conditions ambiantes.
4. Montage à l’aide du support de montage à fluorescence. Laissez le support de montage se déposer pendant la nuit.

2. FLIM
REMARQUE : Le microscope confocal est équipé d’un appareil de microscopie d’imagerie à durée de vie de fluorescence (FLIM).

1. Configurez les paramètres suivants pour le microscope confocal : sténopé, 20 ; longueur d’onde d’excitation, 490 nm ; intensité laser, 0,5 % (correspondant à une puissance moyenne de 7,5 μW). Utilisez des lasers pulsés à 40 MHz.

2. Dans le logiciel FLIM, configurez le comptage des photons sur 550 nm. Dans la fenêtre Paramètres d’affichage, suivez le comptage des photons jusqu’à ce que le nombre maximum soit d’environ 4 000 photons.

3. Enregistrez le fichier et exportez-le en tant qu’image de comptage de photons uniques (SPC).

4. Ajustez les données à une décroissance exponentielle à 2 composantes dans le logiciel FLIM. Un ajustement qui donne un χ² < 2 est bon. La valeur sur l’axe des y est le nombre de comptes pour la durée de vie donnée.

5. Sélectionnez un seuil pour les comptes à inclure, , par exemple , 100. Code couleur par T1 et sélectionnez la plage de durée de vie. La désintégration dépend de la structure amyloïde où la ZLEh est liée. Des durées de vie de fluorescence comprises entre 300 et 1 000 ps ont été observées. Enregistrez le fichier.

6. Exportez les données brutes à l’aide des options d’exportation et enregistrez les données souhaitées dans un nouveau dossier.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
hFTAA/Amytracker545	Ebba Biotech
Dako support de montage fluorescene	Agilent technologies	GM304
LeicaDM6000	Leica
Lumen 200	Prior
Spectraview system	ASI spectral imaging
Spectraview software	ASI spectral imaging
LSM780	Zeiss
Zen 2010b v6.0 software	Zeiss
système FLIM	Becker & Hickl		<
Zeiss
Tunable Laser In Tune	Zeiss

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