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Enregistrement d’images 1.Live
- Préparation des cellules pour l’imagerie en direct
1. Culture WT et CCR5-/- cellules neuronales hypothalamiques exprimant la protéine de fluorescence verte marquée transporteur de glucose 4 (GFP-GLUT4) sur la lamelle en verre #1,5 (ou 0,17 mm d’épaisseur) qui a été pré-enduite de poly-D-Lysine dans la plaque à 6 puits.
2. Retirez délicatement les lamelles avec les neurones à l’aide d’une pince et placez-les avec précaution sur les lames de verre.
3. Retirez l’excès de moyen/liquide avec des lingettes délicates. Pliez les lingettes deux fois et placez-les soigneusement sur le lamelle. Appuyez doucement sur les lingettes sans déplacer la lamelle.
ATTENTION : N’appuyez pas violemment la lamelle contre la lame de verre. Le but de cette étape est de s’assurer que la lamelle ne bouge pas/ne dérive pas pendant l’acquisition de l’image causée par la force de flottabilité.
4. Placez les lamelles et les lames sur la platine du microscope à déconvolution, avec la lamelle vers le bas et correctement fixées. Cette étape permet de s’assurer que la position de la diapositive reste constante afin que les utilisateurs puissent suivre le même ensemble de cellules cibles plus tard.
5. Observez les cellules neuronales hypothalamiques WT et CCR5-/- avec une lentille d’objectif à immersion dans l’huile 60x/1,42 NA.
6. Traitez les échantillons cellulaires sélectionnés avec du CCL5 (10 ng/mL) ou de l’insuline (10 U/mL) pendant une minute. Ajoutez 1,5 μL d’insuline diluée sur le bord de la lamelle.
7. Visualisez et enregistrez immédiatement les échantillons de cellules sélectionnés. Programmez le logiciel d’enregistrement vidéo pour qu’il enregistre pendant 30 min.
2. Microscopie et analyse de déconvolution
NOTE : Cette partie du protocole nécessite l’utilisation d’un microscope de déconvolution et d’un logiciel spécialisé pour l’analyse.
1. Allumez l’alimentation du système d’imagerie, laissez la platine du microscope s’initialiser correctement, puis allumez la source lumineuse LED.
2. Ajouter de l’huile d’immersion (indice de réfraction 1,520 pour les échantillons vivants à 37 °C) sur un objectif 60x 1,42 NA. Placez la lame d’échantillon sur le microscope avec la lamelle tournée vers l’objectif et fixez correctement la lame.
3. Utilisez un éclairage en fond clair ou en fluorescence pour identifier les cellules cibles. Ajustez la mise au point jusqu’à ce que les cellules cibles soient clairement observées. Ne déplacez pas la lentille de l’objectif en dehors de la zone de la lamelle pour éviter des rayures inutiles.
4. Identifier la protéine de fluorescence verte conjuguée Glucose Transporter 4 (GFP-GLUT4) par le signal GFP. Identifiez les cellules cibles souhaitées pour l’acquisition d’images. La position de la cellule cible sélectionnée peut être mémorisée pour référence future (voir Figure 1).
5. Configurez les paramètres expérimentaux appropriés (y compris le nombre de pixels, la longueur d’onde d’excitation, le pourcentage de transmission, le temps d’exposition, l’épaisseur de la pile, l’intervalle de temps et le temps total d’imagerie) sur chaque cellule cible. Pour cette expérience, le nombre de pixels de l’image a été fixé à 512 x 512 (il peut être défini à 1 024 x 1 024 pour une résolution plus élevée) pour les signaux GFP. Le temps d’exposition a été réglé entre 0,025 et 0,05 s toutes les 5 minutes. Les ajustements latéraux mineurs x, y et z peuvent être contrôlés par le logiciel recommandé (voir Tableau des matériaux).
6. Réglez le paramètre d’exposition sur environ 2 000 à 3 000 points pour obtenir une intensité de pixel maximale. Pour minimiser le photoblanchiment par fluorescence, réduisez autant que possible le pourcentage de transmission de la lumière d’excitation tout en maintenant le temps d’exposition inférieur à 1 s. Répétez ces étapes pour chaque canal de fluorescence supplémentaire et chaque zone d’intérêt individuelle.
7. Définissez les limites supérieure et inférieure de la pile Z sur chaque cellule cible. Cela peut être réalisé en déplaçant la platine du microscope jusqu’à ce que le haut et le bas de la cellule cible soient tous deux légèrement flous. Les utilisateurs peuvent ajuster la résolution de l’axe Z en réglant le nombre d’images entre la limite supérieure et la limite inférieure (ce qui peut être fait en réglant la distance entre chaque image).
8. Des piles d’images ont été déconvoluées et analysées ultérieurement à l’aide du logiciel respectif – Velocity de PerkinElmer dans ce cas.
