Analyse microscopique des synapses dans des tranches d’hippocampe de souris par immunofluorescence

Résumé

Source : McLeod, F., et al. Évaluation de la densité des synapses dans des tranches de cerveau de rongeur de l’hippocampe. J. Vis. Exp. (2017).

Cette vidéo présente une méthode de visualisation des marqueurs synaptiques dans des coupes de cerveau d’hippocampe à l’aide de l’analyse d’immunofluorescence confocale. Les coupes sont immunomarquées avec des anticorps primaires ciblant les marqueurs présynaptiques et postsynaptiques, suivis d’anticorps secondaires conjugués au fluorophore. Les marqueurs marqués sont ensuite visualisés à l’aide de la microscopie confocale pour évaluer l’architecture synaptique grâce à leur colocalisation.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.

1. Tranche aiguë d’hippocampe Preparation

1. Retirez le cerveau de la souris le plus rapidement possible, à l’aide d’une spatule et de ciseaux tranchants pour couper le crâne, et placez-le dans du liquide céphalo-rachidien artificiel glacé, oxygéné (95 % O₂, 5 % CO₂), à haute teneur en saccharose (ACSF, ~100 mL).
2. Placez le cerveau de la souris sur une boîte de Pétri et retirez le cervelet et une petite section du cortex frontal avec un scalpel avant de faire un panoramique sur la ligne médiane du cerveau.
3. Place les deux hémisphères du côté qui vient d’être coupé et colle chaque hémisphère sur la platine d’un vibratome.
4. Coupez des sections de 200 à 300 μm d’épaisseur de la région d’intérêt complète. Dans le cas de l’hippocampe, il faut obtenir environ 3 à 4 tranches par hémisphère.
5. À l’aide d’une pipette Pasteur en plastique, transférez les tranches dans une chambre immergée dans de l’ACSF oxygéné (95 % O₂, 5 % CO₂). Maintenir à 34 °C pendant 30 min.
   REMARQUE : À ce stade, les tranches peuvent être traitées avec des agents pharmacologiques actifs, tels que les protéines recombinantes Dickkopf-1 (Dkk1), en ajoutant les agents dans la chambre de tranche.
6. À l’aide d’un pinceau, retirez les tranches de la chambre, placez-les dans une plaque à 24 puits et fixez-les pendant 20 min à 1 h dans 4 % de paraformaldéhyde (PFA)/4 % de saccharose à température ambiante (RT).
   Attention : Le PFA est toxique, portez une protection appropriée.
7. Lavez les tranches trois fois dans 1X de solution saline tamponnée au phosphate (PBS, 10 min chacune).
   REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici pendant 1 à 2 jours, à condition que les tranches soient maintenues à 4 °C dans 1X PBS.

2. Immunofluorescence pour les marqueurs synaptiques

REMARQUE : Les recettes de tous les tampons utilisés se trouvent dans le Tableau 1.

1. Dans les puits de coupe, remplacez le PBS par un tampon de blocage/perméabilisation (Tableau 1) et incubez à RT pendant 4 à 6 h.
2. Diluez l’anticorps polyclonal de cobaye contre le transporteur vésiculaire de glutamate 1 (vGlut1) à une dilution de 1:2 000 dans le tampon de blocage/perméabilisation.
   REMARQUE : vGlut1 est un marqueur pour la visualisation terminale excitatrice pré-synaptique. Pour l’identification des synapses excitatrices post-synaptiques, utilisez un anticorps polyclonal contre la densité postsynaptique-95 (PSD-95) et diluez 1:500 dans la même solution. Utilisez un volume minimum de 300 μL dans chaque puits. Pour identifier l’emplacement anatomique de l’hippocampe, utilisez un anticorps qui peut également identifier la structure neuronale, comme la protéine associée aux microtubules 2 (MAP2) ou la tubuline. Déterminez les concentrations correctes de tous les anticorps primaires pour les marqueurs synaptiques de choix (pré et post-synaptiques) et diluez-les dans un nouveau tampon bloquant/perméabilisant.
3. Incuber les tranches dans la solution d’anticorps primaire pendant la nuit (ou pendant 1 à 2 jours) à 4 °C. Utilisez une plate-forme agitée avec un mouvement vigoureux.
4. Lavez les tranches trois fois dans PBS (10 min chacune).
5. Diluez les anticorps secondaires appropriés 1:500 dans le tampon de blocage. Par exemple, lorsque vous utilisez l’anticorps vGlut1 de cobaye, appliquez un anticorps secondaire qui reconnaît le composant de cobaye (par exemple, un anti-cobaye d’âne) conjugué à un fluorophore spécifique. Lorsque vous utilisez l’anticorps PSD-95 pour lapin, appliquez un anticorps secondaire qui reconnaît le composant de lapin (par exemple, l’anti-lapin d’âne) conjugué à un fluorophore spécifique différent.
6. Incuber les tranches dans cette solution pendant 2 à 3 h à RT. Assurez-vous que les tranches sont protégées de la lumière, car les anticorps secondaires sont sensibles à la lumière.
7. Lavez les tranches trois fois dans PBS (10 min chacune).
8. Retirez soigneusement les tranches de la plaque à 24 puits à l’aide d’un pinceau et placez-les uniformément sur des lames de verre pré-étiquetées. Ajoutez une goutte de support de montage sur chaque tranche, puis placez délicatement une lamelle en verre sur les tranches. Évitez la formation de bulles d’air. Veillez à utiliser suffisamment de support de montage (300-400 μL), car une quantité insuffisante peut entraîner des tranches sèches.
9. Laisser sécher pendant au moins 1 à 2 jours à RT et garder les lames à l’abri de la lumière.
10. Stockez les diapositives à 4 °C à court terme, mais pour un stockage à long terme, conservez-les à -20 °C.

3. acquisition et analyse

1. d’images confocalesImagerie par microscopie confocale à balayage laser.
   1. Identifiez la région de l’hippocampe à imager (par exemple, le cornu ammonis 1 et 3 (CA1, CA3) ou le gyrus denté (DG)) au moyen d’un objectif 10x ou 20x.
   2. Passez à un objectif d’immersion dans l’huile 40x ou 63x pour vous assurer que l’anatomie de la tranche est intacte en identifiant les neurites continus et la structure organisée. Utilisez un marqueur neuronal, tel que MAP2, comme référence (Figure 1A).
   3. Par la suite, passez à un objectif à immersion à l’huile 60x (ouverture numérique [NA] = ~1.3 - 1.4) et ajustez les paramètres de chaque canal pour obtenir un signal et un contraste optimaux. Utilisez une option de contraste élevé/faible pour régler l’intensité de chaque laser afin d’éviter la saturation des pixels.
      REMARQUE : Ces paramètres dépendent du microscope utilisé, mais reportez-vous à la Table des matériaux pour les paramètres de puissance laser. Pour de meilleurs résultats, utilisez une résolution de 1024 x 1024 pixels. Les paramètres doivent rester constants tout au long des différentes conditions d’une même expérience. Un zoom supplémentaire peut être appliqué si nécessaire.
   4. Évalue la profondeur où la coloration est uniforme et acquiert des piles d’images d’au moins 8 plans équidistants (250 nm). Prenez ensuite 3 piles d’images représentatives adjacentes de la même zone d’intérêt par tranche.
      REMARQUE : La profondeur peut varier d’une tranche à l’autre mais doit toujours être d’environ 2 à 5 μm de la surface de la tranche.
   5. Répétez l’acquisition dans au moins 3 tranches par condition et à partir de 6 à 8 animaux par groupe de traitement.

Tableau 1 : Tampons utilisés pour la coloration immunofluorescente.

pH à 7.4 KH₂PO₄

Tampon de blocage/perméabilisation	Concentration	Notes
Sérum d’âne	10 %
Triton-X	0.50 %
PBS	1x
10x PBS	<
NaCl	1.37 M
KCl	27 mM
NaH2PO4	100 mM
18 mM		4 % PFA/4 % Sucrose		pH à 7.4
PBS	1x	Diluer à partir de 10x
PFA	1.33 M
Sucrose	117 mM

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Résultats

Tableau 1 : Tampons utilisés pour la coloration immunofluorescente.

Tampon de blocage/perméabilisation

Matériaux