1. Préparation des tranches organotypiques
REMARQUE : Cette recette utilise deux bébés souris aux jours postnatals 7 à 9 (p7-9), produisant 24 tranches organotypiques divisées en deux boîtes de culture à six puits. Sauf indication contraire, toutes les procédures doivent être effectuées avec une cagoule stérile et des gants en nitrile ou en latex doivent être utilisés. Seuls des ingrédients de qualité culture cellulaire doivent être utilisés.
- Des flacons d’autoclave, des outils de dissection (1 grand ciseau, 1 petit ciseau, 1 grande spatule plate, 1 petite spatule arrondie et aiguisée et 1 pince ; voir la liste des matériaux pour plus de détails), des pipettes en verre, des pointes de pipette et des lingettes en tissu ont été utilisés pour la préparation de la tranche.
- Comme la moitié des pipettes en verre doit être utilisée avec la grande ouverture, cassez l’extrémité étroite.
- Marquez avec un stylo traceur en diamant (si disponible) autour de la pipette juste en dessous du point où le verre commence à se rétrécir. Ensuite, placez l’extrémité pointue de la pipette dans un gant en nitrile ou similaire. Cassez soigneusement l’embout en pliant la pipette tout en la poussant contre un établi.
- Ensuite, émoussez l’extrémité cassée en la frottant sur un morceau de papier de verre ou faites-la fondre légèrement sur un bec Bunsen. Les pipettes cassées sont utilisées pour transférer des tranches de cerveau coupées, l’extrémité cassée étant transformée en poire en caoutchouc et la grande extrémité ouverte touchant la ou les tranches de solution.
REMARQUE : Cela ne se fait pas dans une cagoule stérile et peut être fait plusieurs jours à l’avance.
- Préparez des plats de culture.
REMARQUE : Cela peut être fait la veille du tranchage ou au moins 2 heures avant le tranchage. - Stériliser les membranes en polytétrafluoroéthylène (PTFE) (« confettis »). À l’aide de deux pinces stériles, retirez un seul confetti des morceaux de plastique bleu environnants. Ensuite, stérilisez en le trempant deux fois dans une boîte de Pétri contenant 96 % d’éthanol (EtOH). Ensuite, déposez les confettis à plat dans une grande boîte de Pétri stérile pour les faire sécher.
REMARQUE : Les confettis sont des membranes hydrophiles en PTFE similaires aux membranes des inserts de culture. L’utilisation de confettis facilite l’imagerie en direct, car les tranches individuelles peuvent être facilement transférées de l’insert à la configuration du microscope en soulevant les confettis à l’aide d’une pince (voir 4.8. pour plus de détails). Alternativement, les tranches de cerveau peuvent être cultivées sans les confettis (dans lesquels les tranches se fixeront directement à la membrane de l’insert de culture). Dans ce cas, l’insert de la membrane doit être coupé à l’aide d’un scalpel pour transférer la tranche dans le bain du microscope. - Ajouter 1 mL de milieu de culture dans chaque puits des six boîtes de culture.
- Placez un insert de culture dans chaque puits à l’aide d’une pince stérile. Évitez les bulles d’air entre l’insert et le milieu de culture.
REMARQUE : Pour économiser de l’argent et préserver l’environnement, il est possible de réutiliser les inserts de culture. Cela peut être fait par un rinçage abondant à l’eau distillée (dH2O) suivi d’une incubation dans de l’EtOH à 70 % pendant au moins 24 heures jusqu’à la réutilisation. Lors de la préparation d’une nouvelle culture, faites sécher les inserts dans une plaque de culture cellulaire sous une lumière ultraviolette (UV) pendant 15 à 30 min. - Placez deux confettis (stérilisés et secs) sur chacun des inserts de culture. Placez les confettis vers les bords des inserts pour obtenir un minimum de chevauchement.
- Placez les plaques dans l’incubateur de culture cellulaire à 37 °C avec 5 % de CO2.
- Milieu de dissection à froid à bulles avec gaz biohydroxyde (95 % O2/5 %CO2). Pour que la solution reste stérile, connectez le tube de la bouteille de gaz à un filtre de seringue stérile (pores de 0,22 μm).
- Couplez l’autre extrémité du filtre de la seringue à un tube stérile relié à une pipette en verre stérile. Placez la pipette en verre dans la solution, couvrez-la de parafilm et allumez le gaz. Gardez le milieu de dissection sur de la glace.
- Préparez la zone de dissection/tranchage.
NOTE : Idéalement, cette procédure devrait être effectuée dans une cagoule stérile. Si cela n’est pas possible, le vibratome peut être laissé sur un établi. Dans ce cas, il est recommandé d’utiliser un filet à cheveux et un masque pour le visage. - À l’aide d’une lame de rasoir à un seul tranchant, découpez un morceau rectangulaire (environ 2 cm x 0,5 cm) de gel d’agarose et collez-le sur la platine du vibratome de manière à ce que le côté long fasse face à la lame du vibratome.
- Nettoyez toutes les surfaces et les parties du vibratome avec 70 % d’EtOH et essuyez avec des lingettes en tissu autoclavées.
REMARQUE : Il est important que tous les morceaux qui seront en contact avec le tissu cérébral soient complètement secs car l’EtOH peut endommager les cellules. - Fixez une lame de rasoir stérile au vibratome et effectuez une vérification des vibrations pour voir si le vibratome a cette fonction.
- Placez des outils de dissection autoclavés, des lingettes tissulaires autoclavées, quatre petites boîtes de Pétri, un scalpel à bord rond, deux pipettes en verre avec des ampoules en caoutchouc, deux pipettes en verre à extrémité ouverte (voir partie 1.1) et de la super colle (pulvérisée avec de l’EtOH) dans le capot.
- Versez le milieu de dissection à bulles dans le vibreur et dans les quatre petites boîtes de Pétri.
REMARQUE : Cette étape ne doit être effectuée qu’immédiatement avant la dissection car le milieu à partir de ce moment n’est pas bullé ou maintenu sur de la glace.
- Disséquer et monter des cerveaux.
REMARQUE : Pour obtenir des tranches saines, cette étape doit être effectuée rapidement et précisément. Un peu de pratique est nécessaire. - Euthanasier l’animal #1 par luxation du cou ou selon les directives locales, puis le décapiter avec les gros ciseaux.
- À l’aide de petits ciseaux tranchants, retirez rapidement la peau en faisant une incision sagittale du cou vers le nez et tirez-la de côté pour révéler le crâne.
- Incision le long de la suture sagittale, suivie d’incisions latérales sur la partie intérieure des os frontaux et la suture laboïde (la frontière entre le cerveau et le cervelet).
- Utilisez une pince pour ouvrir le crâne de chaque côté. Les nerfs crâniens sont coupés du cerveau en insérant une spatule arrondie et pointue sous la face ventrale du cerveau et en déplaçant doucement la spatule latéralement.
- Utilisez une lame de rasoir à un seul tranchant pour faire une coupe coronale rostrale au cervelet.
REMARQUE : Cette coupe déterminera l’angle auquel les tranches sont coupées. Il doit donc être fait à angle droit. - Retournez le cerveau hors du crâne et dans une petite boîte de Pétri contenant un milieu de dissection.
- Répétez les étapes 1.6.1. - 1.6.4. pour l’animal #2 et placez ce cerveau dans une deuxième boîte de Pétri.
NOTE : Les animaux ne sont pas stériles. Effectuez la dissection d’un côté de la capuche, puis passez de l’autre côté, propre une fois que le cerveau a été retiré du crâne. - Changez de gants.
- Fixez le cerveau à l’étage du vibratome : ajoutez une fine couche de super colle sur la scène juste devant le gel d’agarose monté. Tenez le cerveau #1 avec une grande spatule plate avec le côté fraîchement coupé (caudal) touchant la spatule et le côté ventral face (et étant aussi proche que possible) du gel d’agarose.
- Ensuite, placez doucement le cerveau sur la colle en le poussant hors de la spatule avec une pince. Assurez-vous de laisser suffisamment d’espace pour le cerveau #2.
REMARQUE : Il est important que les cerveaux soient bien attachés à la scène mais sans excès de colle, car cela peut obstruer la coupe.
- Immédiatement après avoir monté le cerveau #1, utilisez la grande spatule pour ajouter quelques gouttes de milieu de dissection sur le cerveau. Cela gardera le cerveau humide, durcira la colle et l’empêchera de coller aux côtés du cerveau.
- Répétez les étapes 1.6.7 et 1.6.8. pour le cerveau #2.
- Fixez la platine sur le bateau du vibratome.
- Coupez des coupes coronales de 230 μm d’épaisseur avec une amplitude de 1 à 1,5 mm, une fréquence de 85 Hz et une vitesse de 0,2 mm/s. Prélever des tranches d’environ 1,4 mm rostrale et 2,1 mm caudale jusqu’à Bregma.
- Prélevez les tranches après que chaque tranche a été coupée à l’aide de pipettes en verre à extrémité ouverte (partie 1.1). Transférez les tranches dans une boîte de Pétri contenant un milieu de dissection. À l’aide d’un scalpel arrondi, coupez les tranches en deux morceaux, en divisant les deux hémisphères.
- Lorsque toutes les tranches sont coupées, placez-les dans les plats de culture.
- Sortez le plat de culture (un à la fois) de l’incubateur.
- À l’aide des pipettes en verre à extrémité ouverte, transférez soigneusement une tranche sur chacun des confettis.
REMARQUE : Les tranches doivent être posées à plat au milieu des confettis. Cela nécessite une certaine habileté. Cependant, si certaines tranches ne sont pas parfaites, il est préférable de les laisser plutôt que de passer du temps à essayer de les déplacer, car il est important de faire entrer toutes les tranches dans l’incubateur le plus rapidement possible. - À l’aide d’une pipette en verre (extrémité pointue), retirer délicatement l’excédent de fluide sans toucher la tranche.
REMARQUE : Les tranches ne doivent pas être immergées dans un liquide pendant l’incubation. Ainsi, l’excès de milieu doit être aspiré de manière à ce que les tranches soient exposées à l’air (une fine pellicule de milieu recouvrira toujours les tranches). Les tranches qui restent immergées dans le liquide seront généralement malsaines ou mourront (4 et nos observations). - Remettez le plat dans l’incubateur une fois que tous les confettis ont une tranche.
- Répétez les étapes 1.7.8. - 1.8.4. pour le plat #2.
- Changez de milieu de culture.
REMARQUE : Cela doit être fait le lendemain du tranchage (jour 1 in vitro, DIV1) puis tous les 2-3 jours. - Préchauffez le milieu de culture dans un bain-marie ou dans l’incubateur.
- Dans une hotte stérile, utilisez une aspiration sous vide ou une pipette ordinaire avec un embout stérile pour aspirer le milieu de culture de chaque puits. Pour ce faire, il suffit d’incliner doucement la boîte (d’environ 30 degrés) et de placer la pointe de la pipette sur le bord de l’insert de culture.
- Retirer environ 800 μL de chaque puits (en laissant juste assez de milieu pour garder le fond de l’insert recouvert de milieu). Ensuite, à l’aide d’une pipette propre, ajoutez 800 μL du milieu préchauffé dans chaque puits. Ensuite, remettez les plats dans l’incubateur de culture cellulaire.
2. Transduction virale
- Achetez ou fabriquez des virus adéno-associés (AAV) avec un plasmide d’intérêt.
REMARQUE : Ce protocole décrit l’utilisation du sérotype AAV 2/8 (AAV 2/8) portant le dsred ou la GFP ciblés mitochondriaux en tant que gène rapporteur sous le contrôle transcriptionnel du promoteur de la protéine basique de la myéline12 (AAV2/8 MBP_mito_dsred ou AAV2/8 MBP_mito_GFP) pour visualiser les mitochondries oligodendrocytaires. L’AAV 2/8 porteur de la GFP ou de la tdtomato en tant que gène rapporteur piloté par le promoteur général du CAG (AAV 2/8 CAG_GFP ou AAV 2/8 CAG_tdtomato) est utilisé pour visualiser le cytoplasme des oligodendrocytes. Ainsi, la combinaison d’AAV2/8 MBP_mito_dsred avec AAV 2/8 CAG_GFP donne des mitochondries rouges et un cytoplasme vert dans les oligodendrocytes, tandis que la combinaison d’AAV2/8 MBP_mito_GFP et d’AAV 2/8 CAG_tdtomato donne des mitochondries vertes et un cytoplasme rouge. Les constructions sont décrites plus en détail ailleurs13. - Au jour 7 in vitro (DIV7), les oligodendrocytes avec les AAV sont transduits.
ATTENTION : Respectez les règles de sécurité lorsque vous travaillez avec des AAV. Assurez-vous d’avoir la formation appropriée et l’approbation du niveau de biosécurité requise. Tous les points suivants doivent être effectués dans une enceinte de biosécurité de classe II à l’aide de gants et d’une blouse de laboratoire. Ici, l’application de l’AAV à la zone du cortex des tranches est décrite, car c’est la zone qui montre la meilleure récupération. - Diluer l’AAV dans un milieu de culture préchauffé (37 °C). Des dilutions d’environ 2 × 109 copies du génome/mL (GC/mL) sont recommandées pour obtenir une transduction clairsemée d’oligodendrocytes qui permet d’imager des cellules uniques à l’intérieur de la tranche. Cependant, un projet pilote utilisant différents titres doit être effectué pour assurer une densité d’oligodendrocytes transduits qui convient aux expériences spécifiques. Si deux AAV différents sont utilisés, ils doivent être mélangés dans la même solution et ajoutés à la tranche simultanément.
- Ajoutez environ 1,3 μL d’AAV dilué à chaque tranche. Assurez-vous que l’extérieur de la pointe de la pipette est sec. Pipette 1,3 μL d’AAV dilué et tenez la pipette au-dessus du cortex aussi près que possible sans toucher la tranche avec la pointe de la pipette (à environ 1 mm).
- Ensuite, poussez lentement la solution hors de la pipette. Lorsque la solution touche la tranche, déplacez la pointe de la pipette sur le cortex pour répartir la solution sur toute la zone du cortex.
REMARQUE : Cette procédure doit être effectuée aussi rapidement que possible pour éviter de garder les tranches hors du capot plus longtemps que nécessaire. Faites-le sur un plat à la fois et remettez le premier plat dans l’incubateur avant de commencer sur le plat #2. Pour obtenir une distribution satisfaisante de l’AAV sans endommager les tissus, il faut un peu de pratique et une main ferme.
- Si un microscope à fluorescence vertical est disponible dans le laboratoire cellulaire, l’expression des protéines peut être vérifiée pendant le temps de culture en plaçant la boîte sous le microscope.
REMARQUE : Le plat ne doit pas être tenu hors de l’incubateur pendant plus de 2 à 5 minutes.
3. Imagerie en accéléré
REMARQUE : L’imagerie peut être effectuée chaque fois que les niveaux d’expression des marqueurs fluorescents sont suffisants et que les coupes semblent saines (généralement DIV11-14).
- Assurez-vous que le microscope, la perfusion et le chauffage sont correctement réglés afin que la solution d’imagerie à bulles soit chauffée et puisse entrer et sortir du bain.
REMARQUE : Diverses solutions existent pour les chambres de bain. Une version simple est présentée ici. - Faites l’entrée et la sortie du bain à l’aide d’aiguilles de seringue émoussées (pliées à ~45°) qui sont fixées sur les côtés du bain par un blu-tack/fun tack.
- Assurez-vous que la tubulure passe d’une bouteille de solution d’imagerie à bulles continues via la pompe péristaltique, à travers le tube chauffant de l’unité de chauffage, puis jusqu’à l’aiguille de la seringue d’entrée dans le bain.
- Connectez un autre tube à la sortie de l’aiguille de la seringue. Ce tube passe ensuite par la pompe péristaltique et retourne à la bouteille de solution d’imagerie (ou à une bouteille de déchets).
- Solution d’imagerie à bulles avec du gaz bio-oxyde.
REMARQUE : Cela doit être commencé au moins 15 minutes avant l’imagerie et continuer tout au long de l’expérience. - Allumez la pompe péristaltique et le chauffage et faites couler la solution dans le bain pour obtenir une température de bain optimale (37 ± 0,5 °C). Assurez-vous que le capteur du thermomètre connecté à l’unité de température est immergé dans la solution du bain.
- Allumez le microscope, la lampe à fluorescence et les lasers appropriés.
- Mettez en place un chemin lumineux adapté à l’échantillon.
REMARQUE : Cela variera en fonction de la configuration du microscope et de la sonde. Des connaissances générales sur l’utilisation du microscope confocal sont nécessaires et ne seront pas abordées ici. - Utilisez un objectif à immersion dans l’eau avec le grossissement et l’ouverture numérique appropriés (n.a.). Nous utilisons un objectif plan d’immersion dans l’eau-apochromatique 40x (n.a. 1.0).
- Ouvrez le sténopé pour obtenir une section optique d’environ 2 à 2,5 μm pour la vidéo en accéléré. Cela réduit l’apparition de mitochondries qui se déforment pendant le time-lapse.
- Transférez la tranche organotypique dans le bain :
- Ajoutez une goutte de solution d’imagerie ou de milieu de culture dans une petite boîte de Pétri en plastique.
- Dans une hotte stérile, utilisez une pince stérile pour transférer une tranche organotypique de l’insert de la membrane à la goutte. La pince ne doit toucher que les confettis et non la tranche.
- Mettez le couvercle sur la boîte de Pétri.
- Remettez immédiatement la coupelle de culture contenant le reste des tranches dans l’incubateur.
- Apportez au microscope une boîte de Pétri contenant la tranche.
- Éteignez la pompe péristaltique pendant le transfert de la tranche dans le bain de microscope. Tout d’abord, utilisez une pince pour soulever les confettis avec une tranche de boîte de Pétri vers le haut du bain (les confettis flotteront). Placez ensuite les deux pointes de la pince de chaque côté des confettis de manière à ce qu’elles touchent les confettis sans toucher la tranche, et poussez les confettis à travers la solution jusqu’au fond du bain. Centrez les confettis au milieu du bain.
- À l’aide d’une pince, placez l’ancre de maintien (harpe) sur les confettis sans toucher la tranche.
REMARQUE : Une harpe est une ancre en platine en forme de fer à cheval qui est utilisée pour empêcher la tranche de flotter ou de dériver dans le bain. Pour les tranches aiguës, de fines cordes courent d’un côté à l’autre de la harpe (ressemblant à une harpe musicale). Pour les tranches organotypiques, la harpe doit être sans corde et s’adapter à la taille des confettis de manière à ce qu’elle puisse reposer sur les confettis sans toucher la tranche. - Remettez la pompe péristaltique en marche.
- Abaissez l’objectif jusqu’à l’échantillon.
- Sélectionnez la cellule et la région à imager.
REMARQUE : Évitez une exposition excessive des cellules à la lumière laser car cela peut provoquer une toxicité cellulaire (voir les conseils dans les points ci-dessous). - Utilisez les oculaires et la lampe fluorescente pour trouver un oligodendrocyte d’apparence saine avec la bonne expression. En règle générale, les oligodendrocytes qui ont une forte surexpression de la protéine fluorescente semblent malsains. Les oligodendrocytes malsains auront des processus avec une apparence blobby, et les mitochondries apparaîtront fragmentées. Dans les oligodendrocytes sains, le soma et les processus semblent lisses, et les mitochondries ont des longueurs différentes (bien qu’elles soient généralement beaucoup plus courtes que dans les neurones et les astrocytes).
- Placez la cellule d’intérêt au milieu du champ de vision.
- Utilisez la fonction « en direct » du logiciel (pour les microscopes Leica et Zeiss) pour identifier la cellule à l’écran et choisir une zone d’intérêt, par exemple une partie de la cellule qui contient plusieurs processus primaires ou gaines de myéline ou un seul processus ou gaine de myéline.
NOTE : Pour pouvoir imager autant de processus/gaines que possible, choisissez des zones contenant des processus qui reposent relativement à plat dans la direction x-y. - Zoomez sur le champ d’intérêt (produisant généralement une image d’une taille de pixel de 0,14 à 0,30 μm).
- À l’aide de l’outil « régions », dessinez un rectangle autour de la zone et choisissez l’option pour numériser uniquement la région sélectionnée. Le temps de balayage, et donc l’exposition au laser, est réduit en ne balayant que la région sélectionnée.
REMARQUE : Les régions rectangulaires horizontales seront balayées plus rapidement que les régions verticales en raison du nombre plus court de lignes numérisées nécessaires. Si une zone rectangulaire verticale est numérisée, le temps de balayage peut être réduit en faisant pivoter le champ de balayage de 90 degrés (à l’aide de l’outil de rotation).
- Ajustez la puissance et le gain du laser pour obtenir une bonne vue des mitochondries.
REMARQUE : Utilisez la puissance laser minimale nécessaire. Si possible, augmentez le gain plutôt que d’augmenter la puissance du laser. En plus de provoquer une toxicité cellulaire, une puissance laser trop élevée blanchira les objets imagés au fil du temps, nécessitant ainsi une augmentation supplémentaire de la puissance ou du gain laser pendant le balayage. La puissance et le gain laser requis dépendent du niveau d’expression et du microscope. Avec un microscope confocal LSM700, nous utilisons un laser de 555 nm à une puissance de 20 à 40 μW pour imager dsred ou tdtomato, et un laser de 488 nm est utilisé à 20 - 30 μW pour imager GFP (puissance laser mesurée à l’ouverture arrière de l’objectif). Le gain est élevé pour l’imagerie en direct, généralement dans la plage de 700 à 800 pour GFP et de 850 à 980 pour dsred et tdtomato. Le gain élevé peut provoquer un bruit de fond supplémentaire, qui est supprimé en augmentant le décalage numérique (les valeurs de décalage se situent généralement entre 0 et 15). D’après notre expérience, l’utilisation de MBP_mito_GFP donne un meilleur rapport signal/bruit que MBP_mito_dsred. - Sélectionnez la vitesse de numérisation.
REMARQUE : Minimisez le temps de balayage en utilisant une vitesse de balayage rapide et en dessinant une petite région de balayage (voir point 4.10.5 ci-dessous). Il est également possible de gagner du temps de numérisation en effectuant une lecture bidirectionnelle. Cependant, cela n’est pas recommandé en raison de la mauvaise qualité de l’image. - Réglez la fréquence et la durée de l’enregistrement en accéléré, par exemple, capturez des images toutes les 2 secondes pour un total de 20 minutes pour l’imagerie mitochondriale dans les oligodendrocytes.
NOTE : La fréquence et la durée doivent être définies en fonction de la mobilité des objets d’intérêt. Une fréquence plus élevée exposera l’échantillon à plus de lumière laser, mais les objets se déplaçant plus rapidement nécessitent également une durée totale plus courte de vidéos en accéléré (par exemple, les mitochondries dans les neurones, qui se déplacent plus fréquemment et à une vitesse beaucoup plus élevée que les mitochondries dans les oligodendrocytes, sont généralement imagées toutes les secondes pendant un total de 2 minutes16). - Démarrez l’enregistrement en accéléré.
REMARQUE : Les mitochondries peuvent se déplacer hors de la mise au point et/ou dériver hors de la région imagée pendant l’enregistrement. Pour minimiser les vibrations et les mouvements, ajustez l’entrée et la sortie du bain et réduisez la vitesse de la pompe si nécessaire. De petits changements de mise au point se produisent généralement encore. Ainsi, une surveillance continue de l’écran pendant l’imagerie est nécessaire, avec de petits ajustements de la mise au point pendant l’enregistrement.
Capturez une pile z de la cellule entière pour une identification ultérieure de la cellule et du processus imagé.
NOTE : Pour une meilleure résolution, le sténopé doit être réinitialisé à 1 unité aérée pour la pile z.