Imagerie microscopique de neurones dans une section de cerveau de souris à l’aide d’une coloration métallique de Golgi-Cox

Résumé

Source : Louth, E. L., et al. Imagerie de neurones dans des sections cérébrales épaisses à l’aide de la méthode Golgi-Cox. J. Vis. Exp. (2017)

Cette vidéo montre l’imagerie des neurones dans une section de cerveau épaisse colorée par Golgi-Cox en définissant des limites de mise au point supérieure et inférieure et en capturant des images qui se chevauchent. Plusieurs emplacements sont imagés pour assurer des projections neuronales détaillées, qui sont combinées pour créer une représentation 3D.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.

1. Coloration

1. de Golgi-CoxImprégnation de cerveaux de Golgi-Cox
   1. < style='couleur-de-fond :transparent ;couleur :#1a202c ;'>Préparez la solution de Golgi-Cox de 1 % (p/v) de dichromate de potassium, 0,8 % (p/v) de chromate de potassium et 1 % (p/v) de chlorure mercurique en dissolvant le dichromate de potassium et le chromate de potassium séparément dans de l’eau de haute qualité. Mélangez les solutions, ajoutez le chlorure mercurique et filtrez la solution finale à l’aide d’un papier filtre de grade 1. Conservez la solution dans l’obscurité jusqu’à un mois.
   2. Anesthésie la souris avec 5 % d’isoflurane.
   3. Euthanasiez la souris par décapitation et retirez rapidement le cerveau.
   4. Placez le cerveau dans un flacon à scintillation en verre de 20 mL contenant 17 mL de solution de Golgi-Cox et incubez dans l’obscurité à RT pendant 25 jours.
   5. Cryoprotégez le cerveau en le plaçant dans un tube conique de 50 mL contenant 40 mL de cryoprotecteur de saccharose (30 % (p/v) de saccharose dans un tampon de phosphate de 0,1 M, pH 7,4) dans l’obscurité à 4 °C pendant 24 h.
      REMARQUE : Les trois étapes optionnelles suivantes peuvent être utilisées comme alternative au protocole principal, afin de geler le cerveau à ce stade pour un stockage à long terme.
   6. Congelez tout le cerveau en l’immergeant dans 200 mL d’isopentane prérefroidi sur de la glace sèche.
   7. Place le cerveau congelé dans un tube conique de 50 mL et range-le dans l’obscurité à -80 °C.
   8. Lorsque vous êtes prêt à continuer, décongelez le cerveau en le plaçant dans un tube conique de 50 mL contenant 40 mL de cryoprotecteur de saccharose et en le maintenant dans l’obscurité à 4 °C pendant 24 h.
2. Brain Sectioning
   1. Retirez le cerveau du saccharose et bloquez-le pour le sectionnement en coupant le cervelet à l’aide d’une lame de rasoir et en laissant un bord plat à l’extrémité caudale restante du cerveau.
   2. Chauffez la gélose (3 % (p/v) dans de l’eau) jusqu’à ce qu’elle soit fondue, puis laissez-la refroidir jusqu’à ce qu’elle soit légèrement au-dessus de son point de fusion.
   3. Placez le cerveau dans un petit plat de pesée jetable avec son extrémité caudale face vers le bas, et ajoutez une quantité suffisante de gélose fondue pour le couvrir.
   4. Une fois que la gélose s’est solidifiée, coupez l’excès de gélose en laissant environ 2 à 4 mm autour du cerveau, et collez le cerveau au stade d’un vibratome avec son extrémité caudale face vers le bas en utilisant une petite quantité de colle cyanoacrylate d’éthyle.
   5. Remplissez la zone de la scène du vibratome avec une quantité suffisante de cryoprotecteur de saccharose pour couvrir le cerveau, et sectionnez le cerveau à une épaisseur de tranche de 400 à 500 μm (selon la région du cerveau à examiner) en utilisant une fréquence de vibration de 86 Hz et une vitesse d’avancement de la lame de 0,125 mm/s.
   6. À l’aide d’un petit pinceau, placez des sections de cerveau dans un puits d’une plaque de culture tissulaire à 6 puits contenant des inserts à fond de maille disponibles dans le commerce et pré-remplie de 10 mL de saccharose à 6 % (p/v) dans un tampon phosphate 0,1 M, pH 7,4.
   7. Incuber des sections dans l’obscurité à 4 °C O/N.
3. Developing Brain Sections
   1. Transférez des sections de cerveau dans un nouveau puits contenant 5 mL de paraformaldéhyde (PBD) à 2 % (p/v) dans un tampon phosphate 0,1 M, pH 7,4, en utilisant les inserts à fond de maille. Incuber sur un rocker, en se déplaçant lentement dans l’obscurité à RT pendant 15 min.
   2. Les sections doivent être lavées deux fois en les transférant dans de nouveaux puits contenant 5 mL d’eau. Ils doivent être lavés sur un basculeur se déplaçant à vitesse modérée dans l’obscurité à RT pendant 5 min.
   3. Transférez les sections dans un nouveau puits contenant 5 mL d’hydroxyde d’ammonium à 2,7 % (v/v). Incuber sur un rocker, en se déplaçant lentement dans l’obscurité à RT pendant 15 min.
   4. Les sections doivent être lavées deux fois en les transférant dans de nouveaux puits contenant 5 mL d’eau. Ils doivent être lavés sur un basculeur se déplaçant à vitesse modérée dans l’obscurité à RT pendant 5 min.
   5. Transférez les sections dans un nouveau puits contenant 5 mL de fixateur A dilué dans de l’eau 10x par rapport à sa concentration achetée à l’origine. Incuber sur un rocker, en se déplaçant lentement dans l’obscurité à RT pendant 25 min.
   6. Les sections doivent être lavées deux fois en les transférant dans de nouveaux puits contenant 5 mL d’eau. Ils doivent être lavés sur un basculeur se déplaçant à vitesse modérée dans l’obscurité à RT pendant 5 min.
4. Montage de sections de cerveau
   1. À l’aide d’un petit pinceau, montez des sections sur des lames de microscope. À l’aide d’une pince à épiler et d’un petit mouchoir, retirez l’excès d’eau et de gélose. Assurez-vous que toute la gélose est retirée avant de procéder à la déshydratation.
   2. Laisser sécher les sections à l’air libre à RT pendant environ 45 min (sections de 400 μm) ou 90 min (sections de 500 μm).
      REMARQUE : Le moment et le niveau de sécheresse approprié sont critiques et peuvent devoir être déterminés dans chaque laboratoire en fonction de la température et de l’humidité ambiantes. Un temps de séchage trop court entraîne la chute de sections des lames lors des étapes de déshydratation ultérieures, et un temps de séchage trop long entraîne la fissuration des sections. Les sections sembleront toujours brillantes au niveau de sécheresse approprié.
   3. Teignez les sections de violet crésyle en plaçant les lames dans des bocaux de coloration Coplin comme indiqué.
      REMARQUE : Cette étape facultative peut être utilisée pour des sections qui n’ont jamais été gelées pour colorer les noyaux neuronaux avec du violet de crésyle. Nous avons constaté que le nettoyage et la réhydratation des sections avant l’incubation dans le violet de crésyle entraînent une coloration uniforme et un faible bruit de fond sur toutes les sections.
      1. Placer dans l’agent de nettoyage pendant 5 min. Répéter une fois.
      2. Placez dans de l’éthanol à 100 % pendant 5 min. Répétez une fois.
      3. Place 95 % d’éthanol dans l’eau, puis 75 % d’éthanol dans l’eau, puis 50 % d’éthanol dans l’eau pendant 2 min chacun.
      4. Placer dans l’eau pendant 5 min.
      5. Placer dans 0,5 % (p/v) de violet de crésyle dans l’eau pendant 7 min.
      6. Placer dans l’eau pendant 2 min. Répéter une fois.
   4. Déshydratez les sections en plaçant les lames dans des bocaux de coloration Coplin comme indiqué.
      1. Placez 50 % d’éthanol dans l’eau, puis 75 % d’éthanol dans l’eau, puis 95 % d’éthanol dans l’eau pendant 2 min chacun.
      2. Placez dans de l’éthanol à 100 % pendant 5 min. Répétez une fois.
      3. Placer dans l’agent nettoyant pendant 5 min. Répéter une fois.
         REMARQUE : Ces temps de déshydratation et de nettoyage sont suffisants pour traiter les cerveaux de souris comme décrit dans ce manuscrit. Cependant, nous avons observé que pour d’autres espèces, y compris les rats et les vachers, l’étape finale de nettoyage peut devoir être prolongée jusqu’à 15 minutes au total.
   5. Découpe les sections à l’aide d’un support de montage anhydre.
   6. Laisse sécher les diapositives horizontalement dans l’obscurité à RT pendant au moins 5 jours.

2. Imagerie de neurones colorés dans des sections

1. de cerveau épaissesCapture de piles d’images
   1. Allumez l’ampoule du microscope, la caméra et le contrôleur de platine.
   2. Ouvrez le logiciel du microscope (par exemple, Neurolucida).
   3. Placez une lame sur la platine du microscope.
   4. Capturez une image 2D grand angle de la section du cerveau à l’aide d’un objectif à faible grossissement tel que 1.25X 0.4 N.A. PlanAPO ou 4X 0.16 N.A.
      1. Focus sur l’image et ajustez les paramètres de l’appareil photo, y compris le temps d’exposition et la balance des blancs.
      2. Créez un point de référence en cliquant avec le bouton gauche n’importe où sur la section
      3. Capturez l’image en sélectionnant « acquérir une seule image » dans la fenêtre d’acquisition d’image.
   5. Capturez des piles d’images de résolution moyenne de la zone contenant le(s) neurone(s) d’intérêt à l’aide d’un objectif 10X 0.3 N.A. UPlan FL N.
      1. Concentrez-vous sur l’image et ajustez les paramètres de l’appareil photo, y compris l’exposition et la balance des blancs.
      2. Définissez les limites supérieure et inférieure de la pile d’images en vous concentrant sur le haut de la section et en sélectionnant « set » à côté de « haut de la pile » dans la fenêtre d’acquisition d’images, puis en vous concentrant sur le bas de la section et en sélectionnant « set » à côté de « bottom of stack » dans la fenêtre d’acquisition d’images.
      3. Règle la distance de pas à 5 μm en entrant « 5 μm » à côté de « distance entre les images » dans la fenêtre d’acquisition d’image.
      4. Capturez la pile d’images en sélectionnant « acquérir la pile d’images » dans la fenêtre d’acquisition d’images.
      5. Répétez les étapes ci-dessus pour capturer toute la zone d’intérêt, en vous assurant que toutes les piles d’images se chevauchent d’au moins 10 % sur les axes X et Y.
   6. Capturez des piles d’images haute résolution de la zone contenant le neurone d’intérêt à l’aide d’un objectif à immersion dans l’huile de silicone 30X 1.05 N.A.
      1. Appliquez 3 à 4 gouttes d’huile d’immersion silicone sur la lame et placez l’objectif sur la diapositive, en assurant le contact entre l’objectif et l’huile.
      2. Concentrez-vous sur l’image et ajustez les paramètres de l’appareil photo, y compris l’exposition et la balance des blancs.
      3. Définissez les limites supérieure et inférieure de la pile d’images en vous concentrant sur le haut de la section et en sélectionnant « set » à côté de « haut de la pile » dans la fenêtre d’acquisition d’images, puis en vous concentrant sur le bas de la section et en sélectionnant « set » à côté de « bottom of stack » dans la fenêtre d’acquisition d’images.
      4. Définit la distance de pas à 1 μm en entrant « 1 μm » à côté de « distance entre les images » dans la fenêtre d’acquisition d’image.
      5. Capturez la pile d’images en sélectionnant « acquérir la pile d’images » dans la fenêtre d’acquisition d’images.
      6. Répétez les étapes ci-dessus pour capturer toute la zone d’intérêt, en vous assurant que toutes les piles d’images se chevauchent d’au moins 10 % sur les axes X et Y.
   7. Enregistrez le fichier de données et tous les fichiers image au format TIFF pour un traitement externe.
2. Création d’images de projection Z et de montages d’images
   1. Créez des images de projection Z dans ImageJ
      1. Ouvrez le logiciel ImageJ sur lequel le plugin Bio-Formats est installé.
      2. Sélectionnez « plugins » -> « Bio-Formats » -> « Bio-Formats Importer ».
      3. Sélectionnez le fichier de pile d’images à ouvrir.
      4. Une fois le fichier ouvert, changez le format en RVB en sélectionnant « Image » -> « Type » -> « Couleur RVB ».
      5. Créez la projection Z en sélectionnant « Image » -> « Piles » -> « Projet Z... ».
      6. Enregistrez l’image de projection Z bidimensionnelle en tant que fichier TIFF.
   2. Créez un montage d’images bidimensionnel de toute la zone d’intérêt.
      1. Ouvrez le logiciel (par exemple, Adobe Photoshop).
      2. Sélectionnez « Fichier » -> « Automatiser » -> « Photomerge ».
      3. Sélectionnez « Parcourir » puis ajoutez tous les fichiers image à fusionner.
      4. Assurez-vous que « Fusionner les images » est sélectionné, puis sélectionnez « OK ».
      5. Enregistrez l’image de montage résultante de toute la zone d’intérêt sous forme de fichier TIFF.

Matériaux