$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.
1. Immunohistochimie
- Transférer 3 à 5 sections dorsales de l’hippocampe pour chaque souris dans 24 plaques multipuits contenant 500 μl de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 0,1 M pour chaque puits.
- Laver les sections contenues dans chaque puits avec 500 μl de PBS 0,1 M (5 min, 3 fois en secouant doucement).
- Inhiber l’activité de la peroxydase endogène en incubant des sections dans du peroxyde d’hydrogène à 1 % (H2O2) dans le PBS pendant 20 min avec une agitation douce.
- Laver les sections en PBS 0,1 M avec une agitation douce (3 x 5 min).
- Perméabilisation des tissus : incuber des sections pendant 5 min dans 0,2 % de Triton X-100 dans du PBS.
- Au cours des étapes ci-dessus (1.4 ; 1.5), préparez suffisamment de tampon de blocage (10 % de sérum de chèvre et 0,1 % de Triton-X100 dans du PBS) pour l’ensemble de l’expérience (nombre de sections x 100 μl x 3 étapes).
- REMARQUE : Utilisez du sérum de la même espèce chez laquelle l’anticorps secondaire (Ab) (conjugué à la biotine) a été fabriqué.
- Empêcher la liaison non spécifique de l’anticorps en incubant des sections dans un tampon de blocage (100 μl/section) pendant 1 heure à température ambiante (RT) avec une agitation douce.
- Incuber des coupes dans une kinase régulée par le signal extracellulaire phosphorylée primaire (pERK) diluée dans un tampon bloquant pendant une nuit à 4 °C, avec une légère agitation.
- Laver les sections en PBS 0,1 M avec une agitation douce (3 x 5 min).
- Incuber avec l’Ab secondaire conjugué à de la biotine (1:250) diluée dans un tampon bloquant (le même que celui utilisé à l’étape 1.6) pendant 1 heure à RT avec une agitation douce.
- Préparez le réactif du complexe avidine-biotine (ABC) en même temps, car l’avidine et la biotine nécessitent au moins 30 minutes à température ambiante pour complexer.
- Préparez le volume requis de réactif ABC selon le protocole du fabricant.
- Laver les sections en PBS 0,1 M avec une agitation douce (3 x 5 min).
- Incuber des sections pendant 45 min à RT avec le réactif ABC.
- Laver les sections en PBS 0,1 M avec une agitation douce (3 x 5 min).
- Pour préparer une solution de travail à base de diaminobenzidine (DAB), chaque étape impliquant du DAB doit être effectuée dans la hotte, car le DAB est cancérigène et tératogène.
- Transférez la solution DAB sur une nouvelle plaque à l’aide d’une pipette de transfert en plastique.
- Placez les sections dans la plaque contenant la solution de travail DAB et faites tourner lentement la plaque à la main pour permettre une exposition maximale aux sections.
- Surveiller la réaction DAB au microscope jusqu’à ce qu’un signal adéquat se développe (2 à 5 min).
- Arrêtez la réaction à l’intensité de couleur souhaitée en lavant le mouchoir dans 0,1 M PBS (3 x 5 min).
- Utilisez de l’eau de Javel pour désactiver toute solution de substrat DAB restante dans la hotte pendant la nuit et éliminez-la conformément aux directives du laboratoire.
- Montez des sections sur des lames recouvertes de gélatine en les faisant flotter dans du PBS. Ensuite, séchez-les à température ambiante pendant au moins 3-4 heures.
- Déshydratez les sections séquentiellement à 50 %, 70 %, 95 % et 100 % d’éthanol pendant 2 minutes chacune et éliminez les sections à 100 % de xylène pendant 5 min.
- Glissez la lamelle à l’aide d’un produit de montage et laissez-les sécher toute la nuit dans une hotte.