Imagerie de l’activation neuronale de l’hippocampe dans des sections de cerveau de souris

Résumé

Source : Provenzano, G., et al. Visualisation immunohistochimique de l’activité neuronale de l’hippocampe après apprentissage spatial dans un modèle murin de troubles neurodéveloppementaux. J. Vis. Exp. (2015)

Cette vidéo fait une démonstration d’imagerie immunohistochimique pour visualiser l’activation neuronale de l’hippocampe. Des coupes cérébrales colorées révèlent des régions plus sombres au microscope à fond clair, indiquant des neurones activés.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.

1. Immunohistochimie

1. Transférer 3 à 5 sections dorsales de l’hippocampe pour chaque souris dans 24 plaques multipuits contenant 500 μl de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 0,1 M pour chaque puits.
2. Laver les sections contenues dans chaque puits avec 500 μl de PBS 0,1 M (5 min, 3 fois en secouant doucement).
3. Inhiber l’activité de la peroxydase endogène en incubant des sections dans du peroxyde d’hydrogène à 1 % (H₂O₂) dans le PBS pendant 20 min avec une agitation douce.
4. Laver les sections en PBS 0,1 M avec une agitation douce (3 x 5 min).
5. Perméabilisation des tissus : incuber des sections pendant 5 min dans 0,2 % de Triton X-100 dans du PBS.
6. Au cours des étapes ci-dessus (1.4 ; 1.5), préparez suffisamment de tampon de blocage (10 % de sérum de chèvre et 0,1 % de Triton-X100 dans du PBS) pour l’ensemble de l’expérience (nombre de sections x 100 μl x 3 étapes).
7. REMARQUE : Utilisez du sérum de la même espèce chez laquelle l’anticorps secondaire (Ab) (conjugué à la biotine) a été fabriqué.
8. Empêcher la liaison non spécifique de l’anticorps en incubant des sections dans un tampon de blocage (100 μl/section) pendant 1 heure à température ambiante (RT) avec une agitation douce.
9. Incuber des coupes dans une kinase régulée par le signal extracellulaire phosphorylée primaire (pERK) diluée dans un tampon bloquant pendant une nuit à 4 °C, avec une légère agitation.
10. Laver les sections en PBS 0,1 M avec une agitation douce (3 x 5 min).
11. Incuber avec l’Ab secondaire conjugué à de la biotine (1:250) diluée dans un tampon bloquant (le même que celui utilisé à l’étape 1.6) pendant 1 heure à RT avec une agitation douce.
12. Préparez le réactif du complexe avidine-biotine (ABC) en même temps, car l’avidine et la biotine nécessitent au moins 30 minutes à température ambiante pour complexer.
13. Préparez le volume requis de réactif ABC selon le protocole du fabricant.
14. Laver les sections en PBS 0,1 M avec une agitation douce (3 x 5 min).
15. Incuber des sections pendant 45 min à RT avec le réactif ABC.
16. Laver les sections en PBS 0,1 M avec une agitation douce (3 x 5 min).
17. Pour préparer une solution de travail à base de diaminobenzidine (DAB), chaque étape impliquant du DAB doit être effectuée dans la hotte, car le DAB est cancérigène et tératogène.
18. Transférez la solution DAB sur une nouvelle plaque à l’aide d’une pipette de transfert en plastique.
19. Placez les sections dans la plaque contenant la solution de travail DAB et faites tourner lentement la plaque à la main pour permettre une exposition maximale aux sections.
20. Surveiller la réaction DAB au microscope jusqu’à ce qu’un signal adéquat se développe (2 à 5 min).
21. Arrêtez la réaction à l’intensité de couleur souhaitée en lavant le mouchoir dans 0,1 M PBS (3 x 5 min).
22. Utilisez de l’eau de Javel pour désactiver toute solution de substrat DAB restante dans la hotte pendant la nuit et éliminez-la conformément aux directives du laboratoire.
23. Montez des sections sur des lames recouvertes de gélatine en les faisant flotter dans du PBS. Ensuite, séchez-les à température ambiante pendant au moins 3-4 heures.
24. Déshydratez les sections séquentiellement à 50 %, 70 %, 95 % et 100 % d’éthanol pendant 2 minutes chacune et éliminez les sections à 100 % de xylène pendant 5 min.
25. Glissez la lamelle à l’aide d’un produit de montage et laissez-les sécher toute la nuit dans une hotte.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
24 bien plate	Sigma	CLS3524
100 % éthanol	Fisher Scientific	A406-20	Utilisé pour faire un gradient d’éthanol pour la déshydratation avant le montage de la diapositive.
Xylene	VWR	66004-950	Toxique - à utiliser sous le capot. Changez le xylène tous les mois en fonction de l’utilisation.
PBS	Sigma	P3813-10PAK
Triton X-100	Sigma	T-8787
Peroxyde d’hydrogène	Sigma	H1009-100ML
Sérum de chèvre normal	Abcam	G9023-10ML
ABC kit Vectastain	Vector Laboratories	PK-6100	Ajouter dans un volume de 5 ml de PBS 2 gouttes de réactif A, mélanger puis ajouter 2 gouttes de réactif B et mélanger.
substrat de peroxydase DAB	Vector Laboratories	SK-4100	Ajouter un volume de 5 ml d’eau double distillée : 2 gouttes de solution mère tampon et mélanger ; 4 gouttes de DAB et mélanger ; 2 gouttes de peroxyde d’hydrogène et mélanger.
anticorps pERK	Cell Signaling Technologies	4370	Dilution 1:500
anticorps IgG anti-lapin biotinylated	Vector Laboratories	BA-1000	Dilution 1:250
SuperFrost Slides	Carl Roth	1879
Coverslips	Fisher	12-548-B
DPX	Sigma	317616	Support de montage pour diapositives. Un support de montage équivalent peut être utilisé.