Imagerie de la dynamique intracellulaire de l’ATP à l’aide de capteurs basés sur FRET dans une tranche d’hippocampe de souris organotypique

Résumé

Source : Lerchundi, R., et. al. Imagerie de l’ATP intracellulaire dans des coupes de tissu organotypique du cerveau de la souris à l’aide du capteur ATeam1.03YEMK basé sur FRET. J. Vis. Exp. (2019)

Cette vidéo montre l’utilisation de capteurs basés sur FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) pour mesurer les niveaux intracellulaires d’ATP dans des coupes d’hippocampe de souris organotypiques, permettant ainsi de visualiser en temps réel la dynamique de l’ATP dans les neurones et les astrocytes dans des conditions physiologiques et expérimentales.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.

1. Imagerie ATP basée sur FRET (Figure 1)

1. Avant l’expérience, préparez E-ACSF et faites-le bouillonner avec 95 % O₂/5 % CO₂ pendant au moins 30 min pour obtenir un pH de 7,4. Allumez la source de lumière fluorescente (lampe au xénon) du monochromateur (Figure 1). Démarrez la perfusion juste avant de sortir la tranche de l’incubateur.
   REMARQUE : Gardez la solution saline à bulles avec 95 % d’O₂ et 5 % de CO₂ pendant toute la durée de l’expérience.
2. Transférez la tranche dans une chambre expérimentale qui est constamment perfusée avec de l’E-ACSF fraîchement carbogéné à l’aide d’une pompe péristaltique (Figure 1). Ensuite, fixez la tranche avec une grille. Placez la chambre sur la platine du microscope et connectez le système de perfusion. Un tube de laboratoire étanche aux gaz est recommandé pour la perfusion.
   NOTE : Les expériences peuvent être réalisées à température ambiante ou près de la température physiologique, selon le plan d’expérience. Vérifiez la stabilité et la fiabilité de l’écoulement de perfusion pour éviter les changements de focalisation induits par le mouvement du tissu et/ou les changements de contrainte de cisaillement. Les vitesses de perfusion standard pour le travail en tranche, utilisées par nous et de nombreux autres laboratoires, sont de 1,5 à 2,5 mL/min.
3. Mettez la tranche cultivée au point à l’aide d’une lumière à transmission. Identifier la zone où les expériences doivent être effectuées (par exemple : la région CA1 de l’hippocampe). Avant de commencer les expériences d’imagerie, attendez au moins 15 min pour permettre aux coupes de s’adapter aux conditions salines. Pour la configuration du dispositif expérimental, voir Figure 1.
4. Allumez l’appareil photo et le logiciel d’imagerie. Ensuite, sélectionnez le cube de filtre approprié.
5. Exciter la protéine fluorescente du donneur (eCFP) à 435/17 nm (~435 nm). Réglez le temps d’exposition entre 40 et 90 ms.
   REMARQUE : Une forte exposition des tranches à la lumière fluorescente peut entraîner des effets phototoxiques.
6. L’excitation à 435 nm entraîne une émission à 475 nm (eCFP ; donneur) et à 527 nm (Vénus ; accepteur). Divisez l’émission de fluorescence à 500 nm à l’aide d’un séparateur d’image d’émission et utilisez des filtres passe-bande à 483/32 et 542/27 pour isoler davantage la fluorescence du donneur et de l’accepteur. Une forte expression peut entraîner une saturation des détecteurs. Dans ce cas, vous pouvez utiliser un filtre à densité neutre pour réduire l’intensité de l’excitation.
7. Sélectionnez une région d’intérêt (ROI) apparemment dépourvue de fluorescence cellulaire pour la soustraction du bruit de fond. Ensuite, créez des zones d’intérêt délimitant les corps cellulaires.
8. Définissez la fréquence d’acquisition de l’image et la durée globale d’enregistrement. Pour les expériences longues (>30 min), une fréquence d’acquisition de 0,2 à 0,5 Hz est recommandée pour éviter la phototoxicité.
9. Démarrez l’enregistrement. Il est recommandé d’enregistrer au moins 5 min dans des conditions de référence pour assurer la stabilité de la préparation.
   REMARQUE : Ajustez la mise au point de la cellule pendant l’enregistrement si nécessaire.

Résultats

Figure 1 : Configuration de la configuration de l’imagerie FRET. (A) Illustration schématique des différents composants et de leur disposition spatiale nécessaires à la configurat...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
2-deoxyglucose	Alfa Aesar	L07338	Analogue
Filtres passe-bande 483/32	AHF Analysentechnik AG		Filtre
Filtres passe-bande 542/27	AHF Analysentechnik AG		Filtre d’emmision compatible avec le séparateur
Beamsplitter T 455 LP	AHF Analysentechnik AG		Excitation dichroïque miroir
Beamsplitter T 505 LPXR	AHF Analysentechnik AG		Splitter dichroic
Traitement de données Origin Pro 9.0.0 (64- bit)	OriginLab corporation		Logiciel de graphisme scientifique et d’analyse de données
D-glucose monohydrate	Caelo	2580-1kg		DPBS	GIBCO/Life
14190250	Saline
Eclipse E 600FN microscope vertical	Nikon Microscope Solutions
Eclipse FN1 microscope vertical	Nikon Microscope Solutions
Chambre expérimentale	construction personnalisée		Chambre de perfusion pour l’imagerie de cellules vivantes
Hanks' Balanced Salt solution	Sigma-Aldrich	H9394	Avec du rouge phénolique pour la surveillance du
Minimum Essential Medium Eagle	Sigma-Aldrich	M7278	Milieux
Monochromator Polychrome V	Thermo Scientific/FEI		Ultra rapide Commutation du monochromateur
Nikon Fluor 40x / 0.80 W DIC M ∞/0 WD 2.0	Nikon Microscope Solutions		Microscope à immersion dans l’eau Objective
NIS Elements 4.50 advanced Research	Nikon Microscope Solutions		Logiciel d’imagerie. Version améliorée pour l’imagerie
ORCA-Flash4.0	Hamamatsu Photonics		Appareil photo
Tube de perfusion	Pro Liquid GmbH		Tube Tygon, 1.52 x 322 mm (p. : 0.85)
Photoshop CS 6 Version 13.0	Adobe		Logiciel
ssAAV-2/2-hSyn1-ATeam1.03YEMK-WPRE-hGHp(A)	ETH Zürich	v244	Vecteur AAV simple brin qui induit l’expression d’ATeam1.03YEMK sous le contrôle du fragment promoteur de la synapsine 1 humaine hSyn1.
ssAAV-5/2-hGFAP-hHBbI/E-ATeam1.03YEMK-WPRE-bGHp(A)	ETH Zürich	v307	Vecteur AAV monocaténaire qui induit l’expression d’ATeam1.03YEMK sous le contrôle du fragment promoteur de la protéine fibrillaire gliale humaine ABC1D.

de glucose non métabolisable d’emmision compatible avec le séparateur tamponnée au phosphate de Dulbecco pH de culture cellulaire synthétiques FRET CMOS numérique de traitement d’images