Imagerie in vivo à deux photons de la rétine de la souris

Résumé

Source : Wang, Z., et al. Imagerie transpupillaire à deux photons in vivo de la rétine de souris. J. Vis. Exp. (2021).

Cette vidéo présente une technique d’imagerie rétinienne in vivo utilisant la microscopie à deux photons. Les souris anesthésiées sont préparées pour l’imagerie en fixant leur tête, en appliquant un lubrifiant pour les yeux et en plaçant une lamelle sur l’œil. Les cellules ganglionnaires rétiniennes (CGR) exprimant des protéines fluorescentes sont d’abord visualisées à l’aide de l’épifluorescence pour l’alignement. Enfin, l’imagerie à deux photons est utilisée, ce qui permet une visualisation haute résolution des CGR.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Préparation de la souris pour l’acquisition d’images

1. Anesthésie de la souris pour l’imagerie
   REMARQUE : Pour atténuer l’exposition à l’isoflurane, assurez-vous que les gaz résiduaires sont correctement éliminés. Assurez-vous que l’orifice d’échappement de la chambre d’induction de l’anesthésie est connecté à une cartouche de filtre à gaz de balayage passif et que la sortie de la tourelle porte-objectifs d’anesthésie de souris est connectée à une cartouche de filtre à gaz de récupération active avec un vide fourni par un appareil d’évacuation de gaz. Suivez les directives du fabricant pour surveiller le poids de la cartouche de filtre pour le remplacement.
   1. Anesthésier la souris à l’aide du cocktail kétamine/xylazine. Alternativement, induire l’anesthésie par inhalation d’isoflurane si vous utilisez également de l’isoflurane pour le maintien de l’anesthésie (séance d’imagerie > 30 min). Régler l’appareil d’anesthésie pour petits animaux de manière à ce qu’il remplisse la chambre d’induction avec 5 % d’isoflurane mélangé à l’air ambiant à un débit de 0,5 L/min. Placez la souris dans la chambre d’induction et laissez 15 secondes pour que la souris soit anesthésiée.
   2. Mettez le vaporisateur d’isoflurane à 0 % et dirigez le flux d’anesthésie vers le nez. Effectuez une « chasse d’eau O₂ » de 5 secondes de la chambre à induction. Sortez la souris de la chambre d’induction et fixez-la dans le support de tête, en fixant l’embout nasal.
   3. Utilisez un mélange d’isoflurane à 1 % avec de l’air ambiant à un débit de 0,5 L/min pour l’entretien de l’anesthésie. Surveillez la fréquence respiratoire toutes les 5 minutes tout au long de l’anesthésie, en ajustant le pourcentage d’isoflurane pour maintenir une fréquence respiratoire de ~60 respirations/min.
      REMARQUE : Ces paramètres ( % d’isoflurane, débit) peuvent également être utilisés pour le maintien de l’anesthésie induite par le cocktail kétamine/xylazine.
2. Dilatation de la pupille
   1. Préparez une solution de chlorhydrate de phényléphrine à 1 % p/v dans l’eau. Conservez la solution de dilatation à température ambiante à l’abri de la lumière.
   2. À l’aide d’une pipette jetable, appliquez une goutte de la solution de dilatateur sur chaque œil qui sera imagé. Éteignez les lumières de la pièce et attendez 5 min que la pupille se dilate. Lorsque la pupille est dilatée, épongez la solution de dilatateur avec un tissu non pelucheux.
      REMARQUE : Assurez-vous que la solution de dilatateur ne pénètre pas dans les narines.
   3. Appliquez une grosse goutte de gel lubrifiant pour les yeux sur chaque œil qui sera imagé. Si les deux yeux doivent être imagés, appliquez un petit morceau de film plastique sur le gel pour les yeux sur l’œil non imageur pour prévenir la déshydratation. Si vous n’imagez qu’un seul œil, appliquez une pommade oculaire lubrifiante sur l’œil qui ne sera pas imagé.
3. Positionnement de la souris pour l’imagerie
   1. Pour fixer la souris dans le support de tête d’imagerie, tournez le bras principal du support de tête jusqu’à ce que la barre de l’écouteur soit inclinée à un angle de 60° ou plus en dessous de l’horizontale. Fixez la goupille du conduit auditif inférieur en position déployée vers l’intérieur et la goupille du conduit auditif supérieur en position retirée.
   2. Avec la souris face à la barre d’occlusion, montez une oreille sur la goupille inférieure allongée, en insérant la goupille dans le conduit auditif. Desserrez la vis fixant la goupille du conduit auditif supérieur et étendez la goupille dans l’autre conduit auditif. Serrez la vis pour fixer la tête.
   3. Faites glisser la barre de morsure vers la tête de la souris. Surélevez doucement la tête de la souris, puis abaissez les incisives maxillaires de la souris dans le trou de la barre de morsure. Rétractez la barre d’occlusion avec une force douce pour fixer la tête de la souris et sécurisez la position de la barre d’occlusion en serrant la vis.
   4. Si vous utilisez de l’isoflurane, faites glisser le nez à travers sa fente sur la barre de morsure avant de fixer les incisives de la souris. Fixez et serrez la position de la barre d’occlusion comme à l’étape 1.3.3. Serrez l’embout nasal à l’aide des deux vis situées sur sa face supérieure jusqu’à ce qu’il s’adapte parfaitement au nez de la souris, mais ne resserre pas le museau.
   5. Transférez la souris, dans le support de tête, sur la platine du microscope sous l’objectif. Faites pivoter le bras principal du support de tête jusqu’à ce que la pupille de l’œil soit orientée vers le haut, alignée avec le trajet de la lumière (Figure 1).
   6. Placez une lamelle #1.5 dans le porte-filtre compact et fixez-le à la platine du microscope. Abaissez la lamelle vers l’œil, en contactant le gel lubrifiant pour les yeux, de sorte qu’elle se trouve horizontalement immédiatement au-dessus de la cornée (Figure 1). Assurez-vous que la lamelle ne touche pas la cornée.
      REMARQUE : Sur le microscope, assurez-vous que le trajet de la lumière d’excitation est réglé sur l’épifluorescence et que le chemin de la lumière d’émission est réglé sur l’oculaire. Allumez l’illuminateur à épifluorescence à sa puissance la plus basse et ouvrez l’obturateur de l’illuminateur. Choisissez la longueur d’onde de l’illuminateur d’épifluorescence et le filtre de fluorescence correspondant au fluorophore imagé.
   7. Manœuvrez la platine dans les dimensions X-Y et l’objectif en position Z à l’aide de la commande de platine et de l’entraînement de mise au point motorisé jusqu’à ce que la lumière d’excitation à grand champ recouvre complètement la cornée. En regardant à travers l’oculaire, continuez à ajuster la position Z de la platine jusqu’à ce que les cellules ou les structures fluorescentes de la rétine deviennent nettes. Augmentez la puissance de l’illuminateur d’épifluorescence si le signal de l’échantillon n’est pas suffisamment lumineux pour résoudre les cellules individuelles ou les structures d’intérêt à travers l’oculaire.
      REMARQUE : Si vous avez du mal à localiser la rétine, l’iris est un point de repère à contraste élevé sur lequel s’ancrer puis se concentrer vers la rétine. Cette étape permettra également de vérifier que la pupille est dilatée au maximum.
   8. Obtenez une zone d’imagerie sur l’axe avec l’objectif de la souris. Ajustez l’angle de la souris à l’aide des différents degrés de liberté sur le support de tête jusqu’à ce qu’il n’y ait qu’une expansion ou une contraction de la lumière floue lors du réglage du plan focal. Éteignez l’illuminateur à épifluorescence et fermez l’obturateur de l’illuminateur.
      REMARQUE : Une parallaxe X-Y significative de la lumière floue lors du défilement des plans focaux dans la direction Z indique que la rétine n’est pas dans l’axe par rapport à la trajectoire de la lumière d’imagerie.

2. Acquisition d’images à deux photons

1. Paramètres de configuration et d’acquisition d’images
   REMARQUE : Éteignez les lumières de la pièce et couvrez les sources de lumière parasites dans la pièce. Assurez-vous que l’illuminateur d’épifluorescence est éteint et que l’obturateur de l’illuminateur est fermé.
   1. Basculez le chemin de la lumière d’excitation sur le laser et le chemin de la lumière d’émission sur les tubes photomultiplicateurs (PMT).
   2. Dans le logiciel d’acquisition d’images, définissez une taille d’image de 512 x 512 et une moyenne d’image de 3. Réglez les pas par tranche sur -8 μm. Désignez le z-step pour commencer en haut de la pile et progresser vers le bas, en minimisant l’activation laser à deux photons des photorécepteurs.
      REMARQUE : La taille du pas peut être réduite pour augmenter la résolution Z au prix d’une augmentation du temps d’imagerie, mais des pas de 8 μm sont suffisants pour résoudre les somates cellulaires dans cette configuration d’imagerie.
   3. Allumez et activez les PMT. Réglez la tension PMT sur 680 V. Activez l’obturateur d’excitation.
      REMARQUE : Les PMT motorisés sont susceptibles d’être endommagés par la lumière. Assurez-vous que l’illuminateur d’épifluorescence est éteint, que le rideau de l’enceinte du microscope est tiré et que les lumières de la pièce sont éteintes.
   4. Commencez un aperçu en direct du tissu cible, en commençant par une puissance laser de 1 %. Ajustez automatiquement la luminosité de l’écran pour visualiser les cellules ou les structures d’intérêt. Ajustez automatiquement la phase de balayage. Si le tissu cible est sombre ou peu clair, augmentez le pourcentage de puissance du laser jusqu’à ce que les structures deviennent visibles sans dépasser la limite définie à l’étape 2.4.4, qui correspond à 45 mW.
      REMARQUE : Pour une image 16 bits, une valeur d’affichage de ~1000 lors de l’ajustement automatique de la luminosité dans un plan Z contenant des structures d’intérêt indique une luminosité suffisante de l’échantillon.
   5. Manœuvrez la platine du microscope dans la direction X-Y pour la centrer sur une zone d’imagerie souhaitée, puis naviguez vers le plan Z avec les structures d’intérêt au point.
      REMARQUE : L’imagerie adjacente à la tête du nerf optique lui permet de servir de point de repère sans ambiguïté pour les expériences d’imagerie chronique.
   6. S’il s’agit d’une expérience en accéléré chronique, ouvrez une image précédente sur l’ordinateur d’acquisition et utilisez-la comme référence pour trouver la même zone d’intérêt. Assurez-vous que l’angle d’imagerie est similaire à celui des images précédentes pour acquérir le même ensemble de cellules avec une parallaxe minimale.
      REMARQUE : Pour imager les mêmes cellules qu’aux points temporels précédents (Figure 2), un ajustement supplémentaire de la position de la tête de souris est probablement nécessaire.
   7. Définissez les limites Z de la pile d’images en accédant aux plans Z les plus haut et les plus bas d’intérêt, puis acquérez l’image. Une fois l’acquisition de l’image terminée, désactivez les PMT et l’obturateur d’émission. Rebasculez le chemin de la lumière d’émission vers l’oculaire et le chemin de la lumière d’excitation vers l’éclairage par épifluorescence. Retirez la souris de la platine du microscope.

Résultats

Figure 1 : Positionnement des souris pour l’imagerie in vivo. Pour positionner la souris avec la pupille dans l’axe du trajet de la lumière, la souris anesthésiée est d’abord retenue dans un support de tête, la tête est tournée et inclinée, une grosse goutte de gel lubrifiant pour les yeux est placée sur l’œil et la souris est placée sur la scène. U...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
#1.5 lamelle	ThermoFisher	152440	Richard-Allan #1.5 24 mm x 40 mm
50 mL seringue en verre	Hamilton	80950	22G aiguille cimentée
Pompe à air d’anesthésie	RWD Life Science	R510-30
Atropine	Sigma	A0132	Pour la solution
Appareil d’anesthésie de base pour petits animaux	RWD Life Science	R500IE
Capillaire en verre borosilicaté	Sutter	B150-86-10	Diamètre extérieur 1,50 mm, diamètre intérieur 0,86 mm, longueur 10 cm
CFP/YFP cube	filtrant Chroma	custom	480/40, 505 long pass, 535/30
ChromoFlex - Unité de détection PMT à deux canaux	Scientifica	S-MPLG-1002
Pompe à chaleur circulante	Braintree Scientific	tp-700	réglée à 37 °C
Film alimentaire	VWR	10713-916
Porte-filtre compact	ThorLabs	DH1	Tient la lamelle sur l’œil
Cx3cr1-GFP souris transgéniques (B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J)	The Jackson Laboratory	5582
Châssis du contrôleur DAQ	National Instruments	PXIe-1073
Périphérique d’acquisition de données	National Instruments	BNC-2090A
Module FPGA avec numériseur	National Instruments	NI-5734
Appareil d’évacuation de gaz	RWD Life Science	R546W
GenTeal Severe gel lubrifiant pour les yeux	Alcon	(de la pharmacie locale)	Pour une utilisation pendant l’imagerie
GFP/Cube de filtre rouge	Chroma	custom	535/30, 560 long pass, 605/70
Coussin chauffant	McKesson Medical and Surgical	190147
HyperScope Launch Optics pour une utilisation avec Pockels Cell		Scientifica S-MP-101080
HyperScope Module principal	Scientifica	S-MP-100466
HyperScope Scan Path	Scientifica	S-MP-100406
HyperScope X galvo Module	Scientifica	MP-100443
ImageJ Fiji software		Freeware
Isoflurane	Patterson Veterinary	NDC 14043-704-06
Filtre à gaz Isoflurane cannister (nettoyage actif)	RWD Life Science	R510-31
Conteneur de filtre à gaz Isoflurane (nettoyage passif)	RWD Life Science	R510-31S
HCl de kétamine (100 mg/mL)	Vedco	NDC 50989-161-06
M32 vers M26	ThorLabs	M32M26S
MaiTai GUI software	Spectra-Physics	NA
Logiciel MATLAB	MathWorks	NA	R2015b
méloxicam (5 mg/mL)	Boehringer Ingelheim	NDC 0010-6013-01	Analgésique
Micorscope Objective	Edmund Optics	46-404	Mitutoyo WE715042319
extracteur de micropipette	Sutter	Flaming/Brown Modèle P-97
Huile minérale	Fisher	BP2629-1
Pince hémostatique Mini bulldog	Fine Science Tools	18053-28
Tube EVA miniature 0.02 » ID, 0.06 » OD	McMaster Carr	1883T1
Tube EVA miniature 0.05 » ID, 0.09 » OD	McMaster Carr	1883T4
Support de tête de souris	Narishige	SGM-4
No. 5 Forceps	Fine Science Tools	11251-10
Poteaux optiques 1/2"	ThorLabs	TR3-P5
Kit de capteur de puissance optique	ThorLabs	PM100D
pE-300 Ultra LLG Deivery	Scientifica	COO-LED3ULLGs
Chlorhydrate de phényléphrine	Sigma	P6126	Pour la solution
Cellule de Pockels	Conoptics	350-80-02
Amplificateur de cellule de Pockels	Conoptics	Modèle 302RM
Chlorhydrate de proparacaïne	Sigma	1571001	Pour l’immobilisation
Filtre passe-court rouge et rouge lointain Cube	Chroma	custom	560 passe
Pince de poteau rotative 1/2"	ThorLabs	SWC
Paquet ScanImage	Vidrio Technologies	Logiciel	d’acquisition d’images gratuit ; la version 5.4.0 (2018) ; nécessite MATLAB
solution de chlorure de sodium, stérile (0.9 %)	Fresenius Kabi	NDC 63323-186-01
Stereomicroscope	Leica	S9 E
Centrifugeuse de table	Oxford	Benchmate C8
antibiotique Terramycin oxytetracycline/polymyxine B pommade ophtalmique	Zoetisus	NA	À utiliser après injection
Système de refroidissement ThermoRack	Systèmes de refroidissement à semi-conducteurs	ThermoRack 401	réglé à 20 °C
Ultrafast Ti :Laser Sapphire	Spectra-Physics	Mai Tai DeepSee
Vgat-Cre souris transgéniques (Slc32a1tm2(cre)Lowl/J)	The Jackson Laboratory	16962
VGlut2-Cre souris transgéniques (Slc17a6tm2(cre)Lowl/J)	The Jackson Laboratory	16963
VivoScope for In Vivo Imaging	Scientifica	S-MPVS-1200-00P
White petrolatum-mineral oil lubricant eye ongument	Steve		NA For utilisation après imagerie
xylazine HCl (20 mg/mL)	Akorn	NDC 59399-110-20

de dilatateur de pupille de la souris adaptateur de dilatateur de pupille oculaire courte intravitréenne