Imagerie par fluorescence de la dynamique neuro-immune à l’aide d’un implant crânien

Résumé

Source : Bisht, K., et al. Cartographie cérébrale précise pour effectuer une imagerie in vivo répétitive de la dynamique neuro-immune chez la souris. J. Vis. Exp. (2020)

Cette vidéo démontre l’imagerie par fluorescence de la dynamique neuro-immune chez une souris transgénique avec un implant crânien. La stabilité vasculaire et neuronale est immagée en même temps que les changements microgliaux dynamiques, reflétant les réponses immunitaires à l’activité neuronale.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Préparation de la souris pour l’implantation

de la fenêtre crânienneREMARQUE : Diverses lignées de souris transgéniques avec des balises fluorescentes conviennent à l’imagerie.

1. Utilisez des souris CX3CR1GFP/+ pour visualiser la microglie in vivo. En règle générale, on utilise des souris juvéniles à jeunes adultes de 4 à 10 semaines pesant de 17 à 25 g.
   REMARQUE : Bien que cette approche soit même appropriée pour les souris pré-sevrées, la nécessité de retourner les souris dans leurs cages avec leurs mères pour les nourrir peut compliquer la récupération si la mère ne prend pas correctement soin des petits après l’opération. Par conséquent, l’utilisation de souris après le sevrage est recommandée.
2. Anesthésie la souris à l’aide d’isoflurane (5 % de débit d’oxygène pour induction pendant 1 min) dans une chambre d’anesthésie. Vérifiez que la souris ne présente aucun mouvement ou réponse de contraction aux pincements des orteils et/ou de la queue. Sortez la souris de la chambre et, à l’air libre, rasez soigneusement les poils de la tête entre les oreilles à partir du niveau des yeux jusqu’au haut de la région du cou à l’aide d’une tondeuse à cheveux.
   REMARQUE : La concentration d’isoflurane utilisée dépend de la taille de la chambre d’induction. Par conséquent, pour les petites chambres, 3 à 4 % d’isoflurane peuvent être utilisés pour induire efficacement l’anesthésie, tandis que les plus grandes chambres nécessiteront jusqu’à 5 %.
3. Déplace la souris vers le cône nasal de la station de chirurgie stéréotaxique pour l’anesthésie (1,5-2 % pour l’entretien pendant la chirurgie), stabilise sa tête à l’aide de barres d’oreille et maintient la souris sur un coussin chauffant pour garder sa température corporelle au chaud.
4. Lubrifiez les deux yeux avec une pommade pour les yeux. Injectez 100 μL de bupivacaïne à 0,25 % (pour fournir une analgésie locale à la souris qui durera de 8 à 12 h) et 100 μL de dexaméthasone à 4 mg/mL (pour réduire l’inflammation qui peut résulter de la chirurgie) par voie sous-cutanée au site d’incision. Laissez la souris reposer pendant au moins 5 minutes avant de passer à l’étape suivante.
5. Nettoyez le crâne rasé avec trois tampons alternés de bétadine et d’alcool à 70 %. À l’aide d’une lame chirurgicale ou de ciseaux, faites une incision médiane du cuir chevelu s’étendant de l’arrière de la région du crâne entre les oreilles à la zone frontale entre les yeux. Le reste de la peau est coupé pour exposer le crâne.
6. Nettoyez le tissu conjonctif situé entre le cuir chevelu et le crâne sous-jacent avec du peroxyde d’hydrogène à 3 % (H₂O₂) et localisez la zone du cerveau à imager avec des coordonnées stéréotaxiques.
   REMARQUE : Il y a souvent un saignement (étape 1.5) de l’incision à la surface du crâne. Ce saignement se résout généralement de lui-même en 3 à 5 minutes. Le nettoyage avec le peroxyde aide. Un traitement antérieur à la bupivacaïne (étape 1.4) est également noté pour limiter la quantité de saignements pendant cette période.

2. Chirurgie d’implantation de fenêtre crânienne de souris

1. Percez une ouverture circulaire de ~4 mm dans le crâne à l’aide d’un foret dentaire (diamètre de pointe de 0,7 mm) et retirez soigneusement cette partie du crâne à l’aide d’une pince pointue. Pour l’imagerie du cortex somatosensoriel de souris âgées de 6 à 8 semaines, localisez le centre de la craniotomie à -2,5 en arrière et ± 2,0 latéralement par rapport au bregma. Pendant le forage, humidifiez régulièrement le crâne avec une solution saline stérile et des cotons-tiges pour refroidir le cerveau, nettoyer les débris osseux et ramollir l’os du crâne pour une éventuelle ablation.
   REMARQUE : Les coordonnées de la craniotomie varient en fonction de la région d’intérêt et de l’âge des souris.
2. Après avoir retiré le crâne, placez soigneusement un petit couvre-objet (taille #0 à 0,1 ± 0,02 mm d’épaisseur) imbibé de solution saline dans la craniotomie. Séchez l’excès de solution saline à l’aide d’une lingette stérile.
3. À l’aide d’un applicateur pointu (comme une pointe de pipette ou l’extrémité pointue d’un bâtonnet de coton-tige en bois cassé), appliquez la colle cyanoacrylate autour de la fenêtre et laissez-la se fixer sur le cerveau et le crâne. Appliquez la colle primaire sur le reste du crâne et durcissez-le avec une lampe à polymériser pendant 20 à 40 s. Préparez un puits autour de la fenêtre avec la colle finale et polymérisez avec une lampe à polymériser de 20 à 40 s.
4. Collez une petite plaque de tête sur le crâne sur l’hémisphère controlatéral de la craniotomie d’abord avec la colle d’amorce comme amorce, puis avec la colle finale. Durcissez les deux avec la lampe à polymériser pendant 20 à 40 s chacun.
   REMARQUE : Les sutures sont inutiles si le crâne est recouvert de colle pendant cette procédure.

3. Soins post-opératoires

1. Permet à la souris de se réveiller sans anesthésie (la récupération effectuée sur un coussin chauffant raccourcit le temps de récupération) et de la ramener dans sa cage d’origine une fois complètement réveillé. Injecter une dose sous-cutanée de buprénorphine SR (0,5 mg/kg) comme analgésie postopératoire suffisante pendant 72 h.
2. Pour faciliter une récupération saine après l’opération, fournissez à la souris des aliments extra-mous, tels que de la nourriture solide ordinaire trempée dans de l’eau pour la ramollir ou de la nourriture sous forme de gel.
   REMARQUE : Une distribution unique de nourriture molle immédiatement après l’opération est suffisante.
3. Surveille quotidiennement la souris pour la santé et la récupération pendant les 72 premières heures de la procédure chirurgicale. Par la suite, l’imagerie de la chirurgie d’implantation de fenêtre sera effectuée dès 2 semaines.
   REMARQUE : Si c’est bien fait, les souris récupèrent bien en montrant des comportements ambulatoires normaux, une exploration suffisante de la cage, une bonne hydratation, un gain de poids stable et des interactions étendues avec d’autres souris dans la cage et d’autres objets dans la cage. Les souris présentant une léthargie, une déshydratation et une perte de poids supérieure à 10 % après la chirurgie sont euthanasiées et retirées de l’étude.

4. Cartographie cérébrale à deux photons pour l’imagerie initiale

1. Anesthésie la souris (Isoflurane, 5 % d’induction et 1,5 % de maintenance). Stabiliser la tête à l’aide de vis pour monter la plaque frontale sur la platine du microscope à deux photons, maintenue sur une plaque chauffante à 35 °C. Injecter par voie intrapéritonéale 100 μL de colorant pour vaisseaux sanguins tel que la rhodamine B (2 mg/mL).
   REMARQUE : L’imagerie pourrait également être réalisée chez les souris éveillées sans anesthésie. Cependant, des études récentes indiquent que l’anesthésie affecte la dynamique de la surveillance microgliale. La fixation de la tête pour l’imagerie à deux photons chez les souris éveillées augmente le stress même pendant l’imagerie chronique pendant au moins 25 jours.
2. Nettoyez doucement la surface de la fenêtre crânienne à l’aide d’un coton-tige imbibé d’éthanol à 70 %. Mettez quelques gouttes d’eau ou de solution saline sur la fenêtre crânienne et abaissez la lentille de l’objectif dans la solution puisque l’objectif est une lentille d’immersion.
3. Dessinez à la main une carte grossière pour indiquer les principaux points de repère des vaisseaux sanguins dans un cahier de laboratoire tout en regardant à travers l’oculaire par épifluorescence. Utilisez ce dessin pour identifier les régions spécifiques lors de l’imagerie à deux photonns. Vous pouvez également prendre des photos des vaisseaux sanguins à l’aide d’un appareil photo installé sur le microscope ou d’un appareil photo portatif ou d’un téléphone.
   REMARQUE : Ces images et images dessinées à la main sont destinées à faciliter la revisite des mêmes vastes régions au microscope avant l’imagerie à deux photons. Il ne s’agit pas d’un mappage d’image précis.
4. Sous l’imagerie à deux photons, collectez des images de cellules fluorescentes et de vaisseaux si nécessaire. Prenez des notes minutieuses avec les coordonnées appropriées pour vous assurer que les régions précises peuvent être revisitées pour l’imagerie ultérieure. Collectez plusieurs champs de vision lors de cette première séance d’imagerie, par exemple acquérez des images z-stack tous les 1 à 2 μm à travers un volume de tissu.
   REMARQUE : Lors de la collecte d’images par deux photons, les repères des vaisseaux sanguins sont utilisés pour la cartographie grossière. Si une cartographie fine est nécessaire, des dendrites marquées YFP de souris Thy1-YFP sont utilisées.
   1. Utilisez ces paramètres recommandés pour l’imagerie : une longueur d’onde de 880-900 nm est optimale ; pour l’excitation GFP et/ou dsRed / Rhodamine, un miroir dichroïque de 565 nm avec des filtres d’émission 525/50 nm (canal vert) et 620/60 nm (canal rouge) est utilisé ; pour la séparation GFP et YFP, un miroir dichroïque de 509 nm avec des filtres d’émission 500/15 et 537/26 nm est utilisé ; la puissance au niveau du cerveau est maintenue à 25 mW ou moins ; la résolution de l’image est de 1024 x 1024 pixels, le champ de vision pris avec un objectif 25X 0,9 NA avec un facteur de zoom de 1,5X est de 295,24 x 295,24 μm.
5. À la fin de l’imagerie, retirez la souris de la scène, laissez-la se réveiller de l’anesthésie et retourner dans sa cage d’origine jusqu’à une prochaine séance d’imagerie.

5. Imagerie à deux photons et réimagerie

1. Pour les futures sessions d’imagerie ultérieures, qui peuvent durer de quelques heures à des mois après la séance d’imagerie initiale, anesthésier la souris (Isoflurane, 5 % d’induction et 1,5 % d’entretien), monter sur le microscope à deux photons, maintenir sur une plaque chauffante et réinjecter 100 μl un colorant pour vaisseaux sanguins tel que la Rhodamine B (2 mg/mL).
2. Ouvrez les images précédemment obtenues dans ImageJ et, en utilisant ces images ainsi que les notes de la session précédente, identifiez les zones précédemment imagées et re-imagez-les soigneusement.
3. Répétez cette opération aussi longtemps que la fenêtre d’imagerie est claire ou aussi essentielle pour l’étendue de l’étude.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Coverglass (3mm)	Warner Instruments	64-0726
Colle cyanoacrylate (Krazy Glue)	Amazon	https://www.amazon.com/Krazy-Glue-Original-Purpose-Instant/dp/B07GSF31WZ/ref=sr_1_2?keywords=krazy+glue&qid=1583856837&s=pet-supplies&sr=8-2
Demi Ultra LED Curing Light System	Dental Health Products, Inc	910860-1
Dental Drill	Osada : www.osadausa.edu	EXL-M40
Foret	Fine Science Tools	#19008-07
Eye Ointment	Henry Schien	1338333
iBond Total Etch (Primer glue)<	66040094
Rhodamine B	Millipore Sigma	81-88-9 (R6626)
Colle Tetris Evoflow (colle finale)	Top Dent (Ivoclar Vivadent)	#595956
Wahl Brav Mini+	Amazon	https://www.amazon.com/Wahl-Professional-Animal-BravMini-41590-0438/dp/B00IN24ILE/ref=asc_df_B00IN24ILE/?tag=hyprod-20&linkCode=df0&hvadid=167141013968&hvpos=&hvnetw=g&hvrand=12368793083893626704&hvpone=&hvptwo=&hvqmt=&hvdev=c&hvdvcmdl=&hvlocint=&hvlocphy=9008337&hvtargid=pla-332197544154&psc=1

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