Imagerie par fluorescence de la dynamique calcique au niveau des jonctions neuromusculaires du diaphragme d’une souris transgénique

Résumé

Source : Heredia, D. J., et. al. Imagerie ex vivo de la signalisation calcique spécifique à la cellule au niveau de la synapse tripartite du diaphragme de la souris. J. Vis. Exp. (2018)

Cette vidéo démontre l’imagerie par fluorescence de la dynamique calcique au niveau des jonctions neuromusculaires (NMJs) chez une souris transgénique exprimant des indicateurs calciques génétiquement codés. Un NJM est identifié par des récepteurs d’acétylcholine marqués par fluorescence dans le diaphragme avec le nerf phrénique. Un séparateur d’images est utilisé pour visualiser plusieurs signaux simultanément. Un stimulus électrique est délivré et la variation de la fluorescence au niveau de la JNM en réponse à l’afflux de calcium est enregistrée.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’examen éthique des animaux approprié.

1. Préparation des diaphragmes et des nerfs phréniques à partir de souris transgéniques

1. Achetez des souris transgéniques et des amorces oligonucléotidiques pour génotyper ces souris.
   1. Élevez une souris de 3 à 6 mois exprimant une copie de l’allèle Cre-driver transgénique approprié et zéro copie de l’allèle conditionnel GCaMP3/6 avec une deuxième souris du même âge exprimant une ou deux copies de l’allèle conditionnel GCaMP3/6 et zéro copie de l’allèle Cre-driver.
   2. Génotypez les petits et marquez ceux avec les allèles Cre et GCaMP3/6 conditionnels – ceux-ci seront désormais appelés souris doublement transgéniques (par exemple, Myf5-Cre, GCaMP3 conditionnel).
      Note : De cette façon, toutes les données proviendront de souris exprimant une copie des allèles Cre et GCaMP3/6 conditionnel. Ceci est particulièrement important lors de l’ajout d’autres souris mutantes (par exemple, des knockouts) à ces croisements.
2. Lorsque les souris doublement transgéniques ont l’âge approprié (p. ex., jour postnatal 0 ou 5 [P0 ou P5] ou adulte), euthanasiez les souris en les décapitant avec des ciseaux (pour les souris inférieures à P10) ou en les plaçant dans une chambre d’inhalation d’isoflurane. Lorsqu’ils ne réagissent plus au pincement de la queue avec une paire de pinces, ils sont prêts à se sacrifier.
3. Sacrifiez l’animal par décapitation avec une paire de ciseaux.
4. Coupe transversale sur tout l’animal juste en dessous du foie et juste au-dessus du cœur et des poumons avec des ciseaux d’iridectomie.
5. Disséquez le foie, le cœur et les poumons, en prenant soin de maintenir une longueur du nerf phrénique suffisamment longue pour être aspirée dans une électrode d’aspiration (c’est-à-dire 1 à 2 cm).
   Note : Le nerf phrénique gauche peut être identifié comme un morceau de tissu blanc qui pénètre dans la partie médiale du diaphragme gauche. Il ne doit pas être coupé lors de l’ablation des poumons. Le nerf phrénique droit passe à l’intérieur d’un morceau de fascia qui contient également la veine cave supérieure et est plus mince et plus blanc que la veine cave. Ensemble, ils pénètrent tous les deux dans le diaphragme médial droit.
6. Retirez davantage la cage thoracique et la colonne vertébrale, à l’exception de la fine crête autour du diaphragme.
7. Placez le diaphragme et l’échantillon de nerf phrénique dans un tube à microfuge avec une solution de Krebs-Ringer contenant 1 μg/mL de 594-αBTX pendant 10 min dans l’obscurité.
   Note : Cette concentration de 594-αBTX permet de marquer les récepteurs de l’acétylcholine (AChR) sans bloquer leur fonction (observation personnelle).

2. stimulation et enregistrement des potentiels d’action musculaire<

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À l’aide de broches minutieuses, immobilisez le diaphragme en le fixant sur une parabole de 6 cm recouverte de gel diélectrique de silicone et remplie de ~8 ml de solution oxygénée de Krebs-Ringer et placez-la sur la platine du microscope. Perfuser le diaphragme avec plus de solution de Krebs-Ringer (8 ml/min) pendant 30 min.
Note : Cela rince le 594-αBTX non lié, ainsi que l’équilibre du tissu après la dissection.

Fabriquez une électrode d’aspiration selon les méthodes établies.

1. À un grossissement de 4X, à l’aide d’un micromanipulateur, déplacez l’électrode d’aspiration sur le nerf phrénique gauche et appliquez l’aspiration en retirant le canon d’une seringue de 5 ml connectée au tube attaché à l’électrode d’aspiration.
   Note : Lorsqu’il est aspiré avec succès dans l’électrode d’aspiration, le nerf phrénique est tendu. Allumez le stimulateur et stimulez le nerf phrénique en basculant l’interrupteur manuel 1x.
2. Assurez-vous que le diaphragme se contracte en réponse à la stimulation de 1 Hz en l’examinant visuellement avec un éclairage en fond clair. Si ce n’est pas le cas, ajustez la tension en tournant progressivement le bouton de tension pour obtenir une impulsion supramaximale, qui peut être vérifiée par un examen visuel de la contraction musculaire. S’il n’est toujours pas visible, soufflez le nerf avec la seringue et essayez de l’aspirer à nouveau en appliquant une aspiration.

Arrêtez la perfusion et ajoutez l’inhibiteur de myosine spécifique du muscle BHC6 ou l’antagoniste des canaux sodiques voltage-dépendant μ-conotoxine8 à une concentration finale de 100 μM.

1. Pour faire 100 μM BHC, pipetez 4 μL de stock 200 mM dans du DMSO et prédiluez-le dans 1 mL de solution Krebs-Ringer.
2. Retirer 1 mL de solution Krebs-Ringer de la boîte.
3. Ajoutez le BHC prédilué dans le plat.
   Note : Cette prédilution permet d’empêcher l’induction par le DMSO non dilué d’une réponse fluorescente non transitoire dans les cellules exprimant GCaMP3.
4. Attendez 30 minutes, puis allumez la perfusion de la solution fraîche de Krebs-Ringer pendant encore 20 à 30 minutes.

Préparez l’électrode d’enregistrement.

1. En portant des gants, placez un verre filamenté borosilicate d’un diamètre extérieur (OD) de 1 mm et d’un diamètre intérieur (ID) de 0.4 mm dans un extracteur de micropipette, serrez les cadrans pour le fixer en position et fermez la porte de l’extracteur.
2. À l’aide d’un extracteur P-97, programmez les réglages suivants : chaleur à 900, traction à 120, vitesse à 75, temps à 250, pression à 500 et aucune boucle supplémentaire.
   Note : La résistance (R) est mesurée à l’aide des commandes logicielles de l’amplificateur : le logiciel d’acquisition de données confirme la résistance en résolvant la formule V = IR. Le contrôleur logiciel fait passer un courant connu (I) (généralement 1 nA) à travers l’électrode et mesure la variation de tension (V), ce qui nous permet de calculer R.
3. Pour les diaphragmes embryonnaires, assurez-vous que la résistance est proche de 60 MΩ, et pour les diaphragmes plus anciens, de 10 à 20 MΩ. Chargez l’électrode d’enregistrement avec 3 M de chlorure de posatium (KCl).

À un grossissement de 10X, abaissez l’électrode dans le muscle, à l’aide d’un deuxième micromanipulateur situé de l’autre côté de la scène comme électrode de stimulation.

À l’aide d’un logiciel d’acquisition de données électrophysiologiques, attendez que le potentiel de la membrane au repos passe de 0 à -65 mV ou moins.

Stimulez à 1 Hz et vérifiez la présence d’un potentiel d’action musculaire en vérifiant un grand potentiel qui présente un dépassement modeste (potentiel qui dépasse 0 mV lorsqu’il commence à -65 mV ou moins). Ne confondez pas un artefact de stimulation avec un potentiel d’action.
Note : Les potentiels ont une durée significativement plus longue (~5 ms) que les artefacts de stimulation.

3. Imagerie de la fluorescence de l’échantillon

1. À un grossissement de 20X, localisez la bande d’extrémité au centre du muscle en recherchant des jonctions neuromusculaires ou NMJ marquées à 594-αBTX sous excitation lumineuse verte/jaune (550 nm). Passer à l’excitation de la lumière bleue (470 nm) pour l’image Ca²⁺ réponses dans le muscle, motoneurone, ou cellules de Schwann.
2. Si vous le souhaitez, configurez le séparateur d’image avec des filtres passe-bande et un filtre dichroïque à un seul bord pour l’imagerie à double longueur d’onde.
3. Pour calculer la fluorescence maximale (Fmax) présentée par les tissus exprimant GCaMP3/6, ajoutez 12 μL de chlorure de potassium 3 M (KCl) aux préparations de membrane.
   1. Effectuez des expériences avec la barre de luminosité sur la barre de la table de correspondance réglée à 110 % du niveau auquel le tissu exprimant GCaMP3/6 présente une saturation à un grossissement de 20X sans binning en réponse à KCl.
4. Enregistrez à 20 images par seconde pour ne manquer aucun événement rapide.
5. Stimulez avec 1 à 45 s de stimulation nerveuse de 20 à 40 Hz en délivrant un train d’impulsions à l’aide de l’électrode d’aspiration ou ajoutez des agonistes pharmacologiques par application en bain ou par perfusion et collectez des fluorescences dynamiques Ca²⁺ réponses dans un sous-type de cellule avec le signal NMJ statique 594-αBTX.
   Note : Si des souris rouges ou rouges lointaines génétiquement codées (GECI) ou des indicateurs de tension génétiquement codés (GEVI) spécifiques aux tissus deviennent disponibles pour une utilisation au NMJ, ils peuvent être utilisés pour collecter deux signaux dynamiques reflétant deux éléments cellulaires distincts au NMJ.
6. Lorsque l’imagerie ou les expériences électrophysiologiques sont terminées parce que les résultats souhaités ont été obtenus, perfuser l’eau à travers les lignes de perfusion et aspirer l’eau 2x à 3x à travers l’électrode d’aspiration pour s’assurer que les sels ne s’accumulent pas.

Matériaux