Imagerie bicolore de diffusion Raman stimulée du tissu cérébral de souris

Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.

1. Détection du signal SRS

1. 
   REMARQUE : La MOE de 20 MHz est utilisée pour moduler l’amplitude de Stokes. Comme nous le verrons plus loin, l’EOM est dérivé du train d’impulsions laser de 80 MHz, qui est nécessaire pour la modulation orthogonale. D’autres fréquences de modulation peuvent être utilisées si seule une SRS monochrome ou hyperspectrale est effectuée. Dans ce cas, la synchronisation de la fréquence de modulation avec la fréquence laser n’est pas nécessaire. Un générateur de fréquence avec un amplificateur de puissance radiofréquence (RF) peut être utilisé pour piloter l’EOM. Par conséquent, les étapes 1.1.1 à 1.1.4 peuvent être ignorées.
   1. Placez un échantillonneur de faisceau dans le trajet du faisceau Stokes pour capter 10 % du faisceau et l’envoyer à une photodiode rapide pour détecter le train d’impulsions de 80 MHz.
      REMARQUE : Le signal de la photodiode est envoyé à un diviseur de fréquence pour générer une sortie TTL de 20 MHz. Cette sortie est ensuite envoyée dans un tampon de distribution pour répliquer la sortie en quatre sorties identiques de 20 MHz. L’une des sorties est utilisée pour déclencher l’oscilloscope.
   2. Prenez l’une des sorties du tampon de distribution et filtrez-la avec un filtre passe-bande pour obtenir une onde sinusoïdale de 20 MHz. Utilisez un atténuateur RF pour ajuster la tension de sortie crête à crête à ~500 mV.
   3. Envoyez la sortie résultante à un déphaseur, ce qui permet un réglage précis de la phase RF avec une source de tension. Envoyez cette sortie à un amplificateur de puissance RF et connectez la sortie de l’amplificateur à EOM.
   4. Débloquez le faisceau Stokes et optimisez la profondeur de modulation d’EOM1 en plaçant une photodiode dans le trajet du faisceau. Ajustez la tension EOM et la plaque quart d’onde jusqu’à ce que la profondeur de modulation (rapport vallée/crête) semble satisfaisante.
      REMARQUE : À une modulation de 20 MHz (1/4 de la fréquence de répétition laser), deux impulsions sont attendues toutes les 50 ns.
2. Chevauchement temporel
   {TAG_87}}REMARQUE : Le chevauchement temporel de la pompe et du Stokes est obtenu en retardant l’un des deux trains d’impulsions laser avec un rétroréflecteur monté sur un étage de retard (La figure 1 montre le retard du Stokes). Le chevauchement grossier est surveillé par l’oscilloscope, et le chevauchement fin est surveillé par le signal SRS. Un chevauchement temporel fin peut également être obtenu avec un autocorrélateur si disponible.
   1. Placez une photodiode après le miroir dichroïque pour détecter le faisceau laser. Bloquez d’abord le faisceau de Stokes. Zoomez sur l’un des pics d’impulsion de la pompe sur l’oscilloscope. Placez un curseur vertical pour marquer la position temporelle de ce pic avec l’oscilloscope.
   2. Bloquez le faisceau de la pompe et débloquez le faisceau de Stokes. Traduisez l’étage de retard pour qu’il corresponde temporellement à la position de crête sur l’oscilloscope à la position marquée à l’étape précédente. Voir Figure 2 pour un affichage du chevauchement temporel de deux faisceaux.
      1. (FACULTATIF) Si la translation de l’étage de retard est insuffisante pour faire correspondre temporellement les deux faisceaux, déplacez l’étage de retard au milieu de sa plage de mouvement.
      2. Calculez la distance de retard nécessaire pour faire correspondre les deux faisceaux en prenant la différence temporelle entre les deux faisceaux et en multipliant la différence par la vitesse de la lumière pour trouver la quantité de distance nécessaire pour faire correspondre les deux faisceaux temporellement.
      3. Allongez la trajectoire du faisceau le plus rapide ou raccourcissez la trajectoire du faisceau le plus lent pour correspondre à peu près au retard temporel en conséquence.
   3. Préparez un échantillon de lame de microscope avec du sulfoxyde de diméthyle (DMSO) et du ruban adhésif double face comme espaceur pour maintenir l’échantillon entre la lame et une lamelle.
   4. Placez l’échantillon sur le microscope avec le côté de la lamelle face à l’objectif du microscope. Passez le microscope à l’éclairage en fond clair et observez l’échantillon à partir de l’oculaire. Trouvez le foyer de l’échantillon en trouvant d’abord le foyer au niveau des couches supérieure et inférieure des bulles d’air à l’interface verre-ruban, puis déplacez le foyer pour qu’il soit entre les deux couches de ruban.
      REMARQUE : Assurez-vous que les faisceaux laser sont bloqués avant de regarder dans l’oculaire.
   5. Réglez la sortie du faisceau accordable sur 798 nm. En fonction du débit optique du condenseur, ajustez la puissance optique à ~40 mW pour la pompe et les faisceaux de Stokes au foyer de l’objectif.
   6. Ouvrez ScanImage dans MATLAB (ou un autre logiciel de numérisation qui contrôle le microscope) et cliquez sur le bouton FOCUS pour commencer la numérisation.
      REMARQUE : Les faisceaux laser seront balayés par trame à travers l’échantillon pour générer une image. Le signal basse fréquence émis par la photodiode (<100 kHz) est directement envoyé dans le canal 1 de la carte d’acquisition de données (appelé canal CC). La sortie haute fréquence (>100 kHz) de la photodiode est envoyée dans l’amplificateur de verrouillage, et la sortie X du signal de l’amplificateur de verrouillage est envoyée dans le canal 2 de la carte d’acquisition de données (appelé canal CA).
   7. Ajustez le rétroviseur de direction avant le scanner galvo pour centrer le signal DC sur l’affichage du canal 1. Déplacez l’étage de retard motorisé et observez de près la sortie de verrouillage affichée sur l’affichage du canal 2 (c’est-à-dire le canal AC).
      REMARQUE : Lorsque la pompe et Stokes coïncident dans le temps, un signal s’affiche sur le canal AC. Il est utile d’ajuster l’échelle de couleurs du canal AC pour afficher le petit changement d’intensité.
   8. Maximisez l’intensité du signal AC en ajustant finement la temporisation. Ajustez le miroir dichroïque pour centrer le signal SRS sur le canal AC (tout en gardant le canal DC centré). Ajustez la phase de l’amplificateur de verrouillage pour maximiser le signal. Voir Figure 3 pour un signal satisfaisant.

3. Optimisation de la résolution spectrale

REMARQUE : La pompe et les faisceaux Stokes atteignant l’échantillon doivent avoir la même quantité de dispersion de retard de groupe (GDD) pour maximiser la résolution spectrale. La dispersion dépend fortement de la configuration expérimentale. Le dispositif expérimental décrit ici utilise des impulsions femtosecondes à 1 040 nm et 800 nm comme Stokes et pompe, respectivement. Des tiges de verre de silex denses (H-ZF52A) sont utilisées comme moyen d’étirement du pouls.

1. Insérez 48 cm d’une tige de verre hautement dispersive (H-ZF52A ou verre blanc dense équivalent) dans le trajet du faisceau de 800 nm. Estimer le GDD à l’aide de l’égaliseur (1{TAG_250}}) :

   

   REMARQUE : La GVD de divers matériaux en verre à différentes longueurs d’onde peut être trouvée à partir de la ressource de base de données d’indice de réfraction. Par exemple, le H-ZF52A a un GVD de 220,40 fs²/mm à 800 nm. Le GDD total est de 105792 fs².

2. Calculez le nombre de cm de tige de verre dispersive nécessaire à ajouter au trajet du faisceau de 1 040 nm pour correspondre au GDD de la pompe. Insérez la longueur appropriée de tiges de verre dispersif dans le trajet du faisceau de 1 040 nm pour correspondre à peu près au GDD du faisceau de 800 nm. Notez que l’ajout de tiges de verre modifiera le chevauchement temporel des deux faisceaux, et un ajustement du retard peut être nécessaire.
3. Étalonnage de la résolution spectrale
   1. Réaliser un échantillon de lame de microscope avec DMSO. Placez la lame sur le microscope et vérifiez la puissance des faisceaux sortant du condenseur du microscope. Ajustez la puissance en conséquence pour avoir ~40 mW chacun au foyer de l’échantillon.
   2. Ouvrez ScanImage depuis MATLAB. Trouvez le signal SRS maximal en balayant l’étage de retard, qui correspond au pic Raman de 2 913 cm^-1 crête Raman du DMSO. Estimez la position de l’étage en fonction de la position de l’étage précédent avec l’augmentation de la longueur du chemin optique due à l’insertion de tiges. Réalignez le chevauchement spatial du faisceau en raison de la faible déviation du faisceau lorsque des tiges de verre sont ajoutées.
   3. Enregistrez un balayage SRS hyperspectral en prenant séquentiellement une série d’images SRS tout en déplaçant la platine motorisée.
      REMARQUE : La plage de balayage retardé couvre deux pics Raman, correspondant aux pics Raman de 2 913 cm^-1 et 2 994 cm^-1{TAG_337}} de DMSO, respectivement. Ces deux transitions sont observées lors de l’utilisation d’une pompe de 800 nm et d’un laser Stokes de 1 040 nm.
   4. Tracez les spectres SRS de la solution DMSO à l’aide d’ImageJ ou de MATLAB. Ajustez le grand pic DMSO de 2 913 cm^-1} à une fonction gaussienne ou lorentzienne dans MATLAB pour calculer la largeur totale à mi-maximum (FWHM) du pic.
      REMARQUE : Les résultats représentatifs sont présentés dans Figure 4. Si un seul pic large est présent, cela signifie soit que la résolution spectrale est trop faible pour distinguer les deux pics et qu’il faut plus de tiges de verre, soit que la plage balayée était trop petite pour détecter le deuxième pic. En règle générale, une résolution spectrale DMSO acceptable est de ~20-25 cm^-1 lorsqu’une longueur de tige de verre de >60 cm est utilisée. Une résolution plus faible est souvent utilisée pour l’imagerie tissulaire afin d’échanger des signaux plus élevés avec des impulsions plus courtes.
4. (FACULTATIF) Utilisez un autocorrélateur ou un FROG (Frequency-Resolved Optical Gating) pour déterminer la durée d’impulsion de chaque bras afin de calculer exactement la quantité de GDD et la longueur des tiges nécessaires pour faire correspondre le GDD entre la pompe et le Stokes.
5. Répétez les étapes 3.3.2 à 3.3.4 pour différentes longueurs de tige sur le faisceau Stokes afin de trouver la résolution spectrale optimale, ce qui signifie que la meilleure correspondance GDD a été trouvée expérimentalement. Utilisez plusieurs ensembles de tiges de verre de longueur différente pour obtenir une résolution spectrale optimale.

4. Caractérisation signal/bruit (SNR)

1. Assurez-vous que l’étape 4.2 est effectuée après un alignement spatial et temporel complet.
2. Acquérir une image SRS correspondant au pic Raman de 2 913 cm^-1 Raman du DMSO. Ouvrez l’image dans ImageJ et sélectionnez une petite zone au centre du cadre. Utilisez la fonction mesure pour calculer la moyenne et l’écart type des valeurs dans la zone sélectionnée.

3. Divisez la valeur moyenne de la zone sélectionnée par l’écart-type pour trouver la valeur SNR, comme dans Eq (2).

   

   REMARQUE : Un bon SNR pour le système (avec une constante de temps de verrouillage de 4 μs) en utilisant DMSO à 40 mw/40 mw au foyer pour les deux bras est de >800. Des concentrations plus faibles de DMSO ou une puissance plus faible peuvent être utilisées pour une estimation plus précise du SNR si la carte d’acquisition de données a une profondeur de bits limitée.

4. Si le SNR est trop faible, réalignez les impulsions laser pour optimiser le chevauchement spatial, le chevauchement temporel, l’adaptation de la taille du faisceau et de la collimation et/ou l’adaptation de la dispersion. Pour un objectif avec un collier de correction d’aberration, optimisez le signal en ajustant le collier de correction.

5. Étalonnage de l’axe de fréquence

REMARQUE : Cette étape est effectuée pour relier la position de l’étage de retard à la transition Raman balayée. Une sélection minutieuse des solvants est nécessaire pour générer une « règle Raman » appropriée. Le DMSO est un solvant efficace pour les liaisons CH car il présente deux pics Raman aigus à 2 913 cm^-1 et 2 994 cm^-1.

1. Enregistrez un balayage hyperspectral avec la plage d’étape de retard couvrant les pics Raman de 2 913 cm^-1 et 2 994 cm^-1. Enregistrez les positions de platine correspondant au jeu de données hyperspectrales.
   REMARQUE : Le pic maximal global du spectre correspond au DMSO 2 913 cm^-1 et le deuxième pic maximum correspond au DMSO 2 994 cm^-1.
2. Effectuer une régression linéaire pour les positions de scène et les décalages Raman à 2 913 cm^-1 et 2 994 cm^-1. À l’aide de l’équation de régression linéaire reliant la position de l’étage au décalage Raman, convertissez les positions de retard en fréquences Raman correspondantes.

6. Modulation orthogonale et imagerie bicolore

REMARQUE : L’étape de modulation orthogonale n’est nécessaire que lorsqu’une imagerie bicolore en temps réel est nécessaire. Le schéma de ce schéma est illustré dans Figure 5. La modulation orthogonale utilise une paire d’EOM pilotées à un quart de la fréquence laser (20 MHz pour un laser de 80 MHz) avec un déphasage de 90° entre les deux. Cette étape de modulation orthogonale peut être ignorée pour l’imagerie SRS monochrome ou l’imagerie SRS hyperspectrale.

1. Modulation EOM1
   1. Installez un séparateur de faisceau polarisant (PBS2), une plaque quart d’onde (QWP2) et un second EOM (EOM2) dans le trajet du faisceau Stokes après le premier EOM. Débranchez l’entrée du signal sur EOM2. Branchez l’entrée du signal sur EOM1 et allumez-le.
   2. Moduler le faisceau de Stokes (fixé à 1 040 nm) à 20 MHz (f₀/4) en envoyant le faisceau à travers la première EOM. Ajustez l’inclinaison et la position de l’EOM1 pour vous assurer que le faisceau frappe droit et centré à travers le cristal EOM.
   3. Surveillez la profondeur de modulation en observant les deux polarisations sortant de PBS1 avec deux photodiodes et en affichant la modulation sur un oscilloscope.
   4. Ajustez la tension QWP1, EOM1 et la phase de l’entrée 20 MHz (à l’aide d’un décaleur de phase) pour optimiser la profondeur de modulation du faisceau transmis afin qu’elle soit proche de 100 %. Voir Figure 2B pour une illustration d’une bonne profondeur de modulation.
2. Modulation EOM2
   1. Débranchez EOM1 et branchez EOM2.
   2. Envoyez la sortie haute tension du deuxième amplificateur à 20 MHz à EOM2. Ajustez l’inclinaison et la position de l’EOM2 pour vous assurer que le faisceau frappe droit et centré à travers le cristal EOM.
   3. Encore une fois, surveillez la profondeur de modulation en regardant les deux polarisations sortant de PBS2 avec un oscilloscope. Ajustez la tension QWP2, EOM2 et le déphaseur si nécessaire pour obtenir une modulation proche de 100 % pour les deux polarisations.
   4. Assurez-vous que la modulation du train d’impulsions a un déphasage de 90° à partir de la première modulation.
      REMARQUE : Si les deux trains d’impulsions de pompe ne sont pas orthogonaux à 90°, la diaphonie entre les deux canaux posera un problème.
   5. Testez l’orthogonalité de la modulation en allumant et en branchant à la fois EOM1 et EOM2. Surveillez les deux polarisations divisées par PBS2 à l’aide d’un oscilloscope. Réoptimisez EOM1 et EOM2 individuellement si le train d’impulsions après le deuxième PBS ne ressemble pas à Figure 2C.
   6. Installer un cristal de quartz biréfringent (BRC) de 20 mm et une plaque demi-onde (HWP) en aval de EOM2. Branchez les deux EOM à la fois et surveillez le train d’impulsions de manière à ce qu’il ressemble à Figure 2D.
      REMARQUE : Pour le bip utilisé dans cette expérience, un BRC de 20 mm induit un retard qui correspond à un décalage Raman de 80 cm^-1. Une longueur de BRC différente peut être nécessaire si un bip différent est utilisé.
3. Étalonnage
   1. Étalonnez le système à l’aide du DMSO en détectant les signaux provenant de la sortie des canaux X et Y de l’amplificateur de verrouillage (envoyés aux canaux 2 et 3 de la carte d’acquisition de données).
   2. Vérifiez si les signaux générés par le pic de 2 913 cm^-1 atteignent leur pic à partir de la polarisation plus rapide et ceux de la polarisation plus lente sont proches de 90° en déphasage sur l’amplificateur à verrouillage. Si ce n’est pas le cas, ajustez l’alignement EOM jusqu’à ce que les deux signaux soient déphasés de près de 90°.
   3. Une fois l’étalonnage terminé, trouvez la position de retard qui sonde la transition protéique à 2 930 cm^-1 pour l’un des faisceaux orthogonaux. Assurez-vous que l’autre polarisation sonde la transition lipidique de 2 850 cm^-1.

7. Imagerie SRS en mode Epi]{TAG_745}}

REMARQUE : Dans le schéma d’imagerie en mode transmission, l’objectif focalise le laser sur l’échantillon, puis une lentille de condensateur dirige le faisceau transmis vers une photodiode pour une détection de verrouillage. Dans le schéma d’imagerie en mode épi, la lumière qui est rétrodiffusée et dépolarisée par l’échantillon est collectée par l’objectif de focalisation et isolée à l’aide d’un séparateur de faisceau polarisant. Les photons isolés et rétrodiffusés sont envoyés à une photodiode à travers une paire de lentilles relais pour une détection de verrouillage. La figure 6 illustre le schéma d’imagerie en mode épi.

1. Installez un HWP avant que le faisceau n’entre dans le microscope pour modifier la polarisation du faisceau entrant dans le microscope. Placez un PBS au-dessus de l’objectif pour permettre au faisceau rétroréfléchi dépolarisé d’atteindre le détecteur.
2. Utilisez une paire d’objectifs composés d’une lentille achromatique de 75 mm et d’une lentille asphérique de 30 mm pour relayer les photons rétrodiffusés de l’ouverture arrière de l’objectif vers le photodétecteur. Montez le détecteur pour recueillir la lumière rétrodiffusée dirigée par le PBS. Installez un filtre pour empêcher le faisceau modulé de pénétrer dans le détecteur.
3. Placez l’échantillon de tissu sous l’objectif. Comme le condenseur n’est pas nécessaire pour l’imagerie en mode épi, retirez-le si vous avez besoin de plus d’espace.
4. Imagerie
   1. Bloquez le faisceau avec un obturateur ; dirigez une source de lumière blanche sur l’échantillon par le côté ; et utilisez Brightfield pour trouver une mise au point objective.
   2. Débloquez les deux faisceaux et utilisez les positions de retard précalibrées pour acquérir des images SRS lipidiques et protéiques à partir des tissus à partir des deux sorties de l’amplificateur de verrouillage.
   3. Ajustez le gain de verrouillage et le facteur de bac de pixels pour obtenir des images de bonne qualité.

8. Coloration de fausses couleurs

1. {TAG_821}}Ouvrez la pile d’images avec ImageJ.
2. Extrayez les deux images qui correspondent à l’espèce lipidique (^-1) et à la protéine (2 930 cm^-1{}}{TAG_840}}) en cliquant avec le bouton droit de la souris sur l’image et en cliquant sur Duplicate.
3. Renommez l’image lipidique en lipides {TAG_858}} et l’image protéique en {}}TAG_862{}}.
4. Allez à Processus | Calculatrice d’images et effectuer protéines soustraire {}}lipides.
5. Combinez les images en allant dans Image | Couleur | Fusionner les canaux, en définissant lipides à {{TAG_907 TAG_908}}{{}}vert {TAG_912}} et {}}TAG_916{TAG_917}} en } bleu}{TAG_924}}. Ouvrez l’outil {TAG_928}} (Image | Couleur | Outil Canaux) et ajustez la luminosité et le contraste (Image | Ajuster | Luminosité/Contraste).
6. Ajustez la luminosité et le contraste de chaque canal à l’aide de l’outil canaux . Pour le canal lipidique, ajustez le contraste jusqu’à ce que les caractéristiques cellulaires apparaissent sombres. Pour le canal protéique, ajustez le contraste jusqu’à ce que les caractéristiques cellulaires apparaissent en bleu. Convertissez l’image verte/bleue du canal fusionné en une image RVB en allant dans Image | Type | Couleur RVB. Exporter cette image par Fichier | Enregistrer sous | Tiff.
   REMARQUE : Pour les fausses coloration H&E, le schéma de couleurs montre un cytoplasme rose, tandis que les noyaux sont bleu-violet foncé.
7. Téléchargez le script MATLAB HE.m à partir de la ressource de script false H&E staining dans la table des TAG_983 matériaux {}}}.
8. Exécutez le script HE.m dans MATLAB. Sélectionnez l’image RVB exportée de l’étape précédente pour générer une image artificiellement colorée H&E.
9. (FACULTATIF) Normalisez l’intensité de l’image pour l’imagerie à grand champ de vision, car l’image apparaît plus sombre à la périphérie qu’au centre.
   1. Pour effectuer la normalisation de champ des images, faites la moyenne du plus grand nombre d’images possible. Ensuite, supprimez les fonctions d’intensité avec ImageJ (Process | Filtres | Flou gaussien | Rayon = 50).
   2. Mesurez l’intensité maximale de l’image floue (Ctrl+M). Diviser l’image floue par l’intensité maximale (Processus | Mathématiques | Diviser). Divisez l’image SRS brute par l’image floue (Processus | Illustration | Calculatrice).

Figure 1 : Schéma de la configuration d’imagerie SRS monochrome. Construction d’un microscope SRS à focale spectrale en mode transmission. X et Y représentent les sorties orthogonales. Abréviations : SRS = diffusion Raman stimulée ; DL = ligne à retard basée sur un rétroréflecteur ; Div = diviseur ; FB = tampon de distribution ; AT = atténuateur ; PS = déphasage ; PA = amplificateur de puissance ; DCM = miroir dichroïque ; GM = miroirs galvo ; EOM = modulateur électro-optique ; POM = miroir de prélèvement ; PBS = séparateur de faisceau polarisant, BRC = cristal biréfringent ; QWP = plaque quart d’onde ; HWP : plaque demi-ondulée ; PD = photodiode ; GR = tige de verre ; BB = Bloc de poutre ; SPF = filtre passe-court ; CL = lentille collimative ; BS = lentille changeante de taille de faisceau.

Figure 2 : Chevauchement temporel représentatif. (A) On voit que la pompe et les faisceaux de Stokes se chevauchent temporellement sur l’oscilloscope. Les curseurs de l’oscilloscope sont utilisés pour marquer les positions temporelles de la pompe et des faisceaux de Stokes. Ce chevauchement est satisfaisant comme point de départ pour peaufiner davantage le chevauchement temporel avec une étape de retard. (B) Profondeur de modulation représentative satisfaisante d’une EOM à 20 MHz. (C) Modulation d’impulsion satisfaisante pendant l’utilisation de deux EOM. (D) Modulation satisfaisante du train d’impulsions après l’installation d’un cristal de quartz biréfringent et d’une plaque demi-onde sur le bras de Stokes doublement modulé. Abréviation : EOM = modulateur électro-optique.

Figure 3 : Signaux SRS et pompes représentatifs. (A) Signal de pompe mal aligné détecté dans le canal DC. (B) Signal SRS mal aligné détecté par la photodiode. (C) Signal de pompe satisfaisant et centré dans le canal DC. (D) Signal SRS satisfaisant centré sur le canal AC. Abréviation : SRS = diffusion Raman stimulée.

Figure 4 : Caractérisation de la résolution spectrale. Une fonction gaussienne était adaptée aux 2,913 cm-1 Raman DMSO peak. Le FWHM calculé a donné une résolution de 15 cm-1 pour le système. Abréviations : DMSO = diméthylsulfoxyde ; FWHM = pleine largeur à la moitié maximum.

Figure 5 : Schéma de la configuration d’imagerie SRS bicolore. Construction d’un microscope SRS bicolore en mode transmission. X et Y représentent les sorties orthogonales. Abréviations : DL = ligne à retard basée sur un rétroréflecteur ; Div = diviseur ; FB = tampon de distribution ; AT = atténuateur ; PS = déphasage ; PA = amplificateur de puissance ; DCM = miroir dichroïque ; GM = miroirs galvo ; EOM = modulateur électro-optique ; PBS = séparateur de faisceau polarisant ; BRC = cristal biréfringent ; QWP = plaque quart d’onde ; HWP = plaque demi-onde ; PD = photodiode ; GR = tige de verre ; BB = bloc de faisceau, SPF = filtre passe-court ; CL = lentille collimative ; POM = miroir de prélèvement ; BS = lentille changeant la taille du faisceau.

Figure 6 : Schéma de la configuration en mode Epi-mode d’imagerie SRS bicolore. Construction d’un microscope SRS bicolore en mode épi. X et Y représentent les sorties orthogonales. Abréviations : DL = ligne à retard basée sur un rétroréflecteur ; Div = diviseur ; FB = tampon de distribution ; AT = atténuateur ; PS = déphasage ; PA = amplificateur de puissance ; DCM = miroir dichroïque ; GM = miroirs galvo ; EOM = modulateur électro-optique ; PBS = séparateur de faisceau polarisant ; BRC = cristal biréfringent ; QWP = plaque quart d’onde ; HWP = plaque demi-onde ; PD = photodiode ; GR = tige de verre ; BB = bloc de faisceau, BPF = filtre passe-bande ; CL = lentille collimative ; POM = miroir de prélèvement ; BS = lentille changeant de taille de faisceau.