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Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.
1. Analyses morphologiques de neurones granulaires cérébelleux ou CGN - reconstruction tridimensionnelle (3D) et surface et volume cellulaire
- Imagez des CGN électroporés uniques sur un microscope confocal à un objectif 63x avec un zoom 2x, en prenant des images z-stack à 0,5 μm par pile. Imagez une cellule par fenêtre d’image pour permettre une analyse et une reconstruction faciles de l’image.
- Installez le plug-in Simple Neurite Tracer pour FIJI à l’aide du lien suivant (https://imagej.net/Simple_Neurite_Tracer:_Basic_Instructions) pour tracer facilement et efficacement la structure des CGN électroporés dans un espace tridimensionnel (3D).
NOTE : Il existe une version mise à jour du plug-in (https://imagej.net/SNT).
- Analysez la longueur des neurites et la formation des griffes dendritiques à l’aveugle à l’aide d’un traceur de neurite simple. Téléchargez des images z-stack monocanal de CGN électroporés sur FIJI, et cliquez sur Plugins | Segmentation | Neurite simple traceur (Figure 1D).
- Accédez au menu déroulant et sélectionnez Créer une visionneuse 3D (Figure 1D).
- Faites défiler jusqu’à la base d’une dendrite, où elle se connecte à la cellule soma, et commencez un chemin en cliquant sur la jonction. Tracez manuellement le chemin en cliquant sur les sections où le signal de remplissage de cellule est le plus brillant, en appuyant sur [y] pour conserver le tracé. Tracez jusqu’à la fin de la dendrite si elle ne contient pas de griffe ou jusqu’à la base de la griffe et confirmez le chemin en appuyant sur [f] (Figure 2D).
- Ensuite, tracez la griffe en commençant un chemin à la base de la structure et en traçant jusqu’à la fin du neurite le plus long. Tracez les branches secondaires et tertiaires en maintenant la touche [ctrl] enfoncée sous Windows ou [alt] sous Mac OS et en cliquant sur le chemin d’accès. Confirmez le chemin d’accès en appuyant sur [f].
- Observez que les mesures des traces sont visibles sur une fenêtre séparée ; Additionnez toutes les mesures des branches de la griffe (primaire, secondaire, tertiaire) pour obtenir la longueur totale de chaque griffe.
- Pour analyser la surface et le volume cellulaire des CGN électroporés, téléchargez le logiciel d’analyse de cellules Imaris (https://imaris.oxinst.com/).
NOTE : FIJI peut également être utilisé pour reconstruire des cellules en 3D à partir d’images z-stack en utilisant des plug-ins facilement disponibles et gratuits. De plus, Simple Neurite Tracer dispose d’une fonction de rendu volumétrique, mais Imaris a été utilisé pour les raisons décrites ci-dessous.
- Téléchargez une image z-stack d’un CGN électroporé sur Imaris. Accédez à la boîte à outils de reconstruction 3D en appuyant sur Surpasser.
- Pour reconstruire le CGN, appuyez sur Surfaces et sélectionnez une région d’intérêt qui englobe l’intégralité de la cellule dans la fenêtre d’image. Une fois terminé, appuyez sur la flèche bleue vers l’avant dans le coin inférieur droit sous Créer.
- Si l’image contient plusieurs canaux pour différents signaux, sélectionnez le canal contenant le CGN électroporé et appuyez sur la flèche bleue vers l’avant.
- À l’aide de la barre latérale, définissez le seuil souhaité qui correspond le plus précisément au signal de la cellule électroporée. Zoomez plus près de la surface de la cellule pour déterminer avec précision le seuil. Une fois terminé, appuyez sur la double flèche verte pour reconstruire la cellule et obtenir la surface et la taille du volume à partir des métadonnées.
