Imagerie simultanée de la dynamique microgliale et de l’activité neuronale chez une souris éveillée

Résumé

Source : Maruoka, H., et. al. Imagerie simultanée de la dynamique microgliale et de l’activité neuronale chez les souris éveillées. J. vis. exp.. (2022)

Cette vidéo montre une procédure de microscopie à deux photons pour imager l’activité neuronale et la dynamique microgliale chez une souris éveillée pendant une stimulation visuelle, en mettant en évidence les transitoires calciques et les interactions cellulaires.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

Imagerie in vivo à deux photons de la microglie et de la dynamique calcique neuronale

1. Habituation des souris à l’appareil microscope

1. Trois semaines après l’opération, induire une anesthésie chez la souris avec de l’isoflurane à 3 % et placer la souris sous l’objectif 25x d’un microscope à deux photons à l’aide d’un instrument stéréotaxique fabriqué sur mesure (Figure 1C). Pour la configuration, la souris est placée sur le dessus d’un tapis roulant et autorisée à fonctionner librement.
2. Environ 10 minutes plus tard, retirez la souris de la platine du microscope et remettez-la dans la cage de la maison. Répétez l’accoutumance au moins 3 fois tous les deux jours avant l’acquisition d’une image à deux photons.

2. Acquisition d’images à deux photons

REMARQUE : Nous recommandons d’effectuer l’acquisition d’images plus de 4 semaines après l’opération, car l’activation microgliale revient progressivement au niveau basal.

1. Induisez une anesthésie chez la souris avec de l’isoflurane à 3 % et placez la souris sous la lentille de l’objectif du microscope à deux photons à l’aide d’un instrument stéréotaxique sur mesure.
2. Installez le dispositif d’ombrage personnalisé (Figure 1A et Figure 1B) et un moniteur LCD pour la stimulation visuelle comme décrit ci-dessous (Figure 1D).
   1. Positionnez la lentille pour qu’elle fasse la mise au point sur la surface du cerveau, puis définissez cette position sur la position Z d’origine. Gardez les coordonnées x-y constantes et élevez l’objectif ; Retirez la souris et l’instrument stéréotaxique de l’objectif et du tapis de course.
   2. Fixez un dispositif d’ombrage sur le dessus de la plaque de tête à l’aide de silicone, qui est noirci en le mélangeant avec de la poudre de charbon de bois, et assurez-vous que l’espace entre la plaque de tête et le dispositif d’ombrage est bien scellé.
   3. Remplissez le dispositif d’ombrage avec de l’eau distillée, puis fixez à nouveau la souris et le cadre stéréotaxique sous l’objectif et sur le tapis roulant. Réinitialisez soigneusement le plan focal à la surface du cerveau, en vérifiant la profondeur de la lentille de l’objectif.
      REMARQUE : Pour éviter le risque d’endommager la lentille de l’objectif, réglez d’abord les coordonnées xyz, puis appliquez le dispositif d’ombrage de la lentille de l’objectif. Il est également raisonnable d’installer d’abord le couvercle, puis d’ajuster les coordonnées, mais une manipulation prudente est nécessaire pour cette option.
   4. Couvrez la lentille de l’objectif avec une feuille d’aluminium noire pour éviter la contamination par la lumière de l’écran LCD utilisé pour la stimulation visuelle à travers la lentille de l’objectif (Figure 1D). Placez un écran LCD de 10 pouces à 12,5 cm devant les yeux de la souris pour présenter les stimuli visuels (Figure 1D).
3. Configurez les filtres de collecte d’émission de fluorescence sur la fluorescence EGFP (filtre d’émission 525/50 nm) et la fluorescence R-CaMP (filtre d’émission 593/46 nm) et la longueur d’onde d’excitation sur 1 000 nm. Acquérez des images avec une résolution spatiale de 0,25 μm/pixel à l’aide d’un objectif NA 25x 1,1 et de PMTs GaAsP.
4. Trouvez la région d’imagerie dans laquelle les neurones R-CaMP (+) et la microglie EGFP (+) peuvent être imagés simultanément dans la couche 2/3. Pour cette configuration, les données obtenues dans Figure 2 étaient à une profondeur de 100 μm de la surface du pial, en utilisant un aperçu d’image en direct. Maintenez la puissance du laser d’excitation aussi faible que possible pour éviter le photoblanchiment et les dommages causés par l’augmentation de la température locale dans la région d’imagerie.
5. Acquérez des images à la fréquence d’images de 30 Hz. Simultanément à l’acquisition d’images, présentez des stimuli visuels dérivants-réseau à 100 % de contraste, 1,5 Hz, 0,04 cycles par degré dans 12 directions à 6 orientations de 0° à 150° par pas de 30° à la souris.
6. Après l’acquisition de l’image, retirez la souris de la platine du microscope, détachez le dispositif d’ombrage et l’instrument stéréotaxique de la souris et remettez la souris dans sa cage d’origine.

Résultats

Matériaux