Quantification de neurones nouvellement générés dans le tissu cérébral d’un rat à l’aide de la technique du fractionneur optique

Abstract

Source : Olesen, M. V., et al. La technique de fractionnement optique pour estimer le nombre de cellules dans un modèle de rat de thérapie électroconvulsive. J. Vis. exp. (2017).
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p style='line-height :1.380000000000001 ;margin-bottom :0pt ;margin-top :0pt ;text-align :justify ;' dir='ltr'>La vidéo montre la technique de quantification des neurones nouvellement générés dans le tissu cérébral. Des coupes de tissu hippocampique contenant des neurones marqués à la bromodéoxyuridine (BrdU) ont été colorées à l’aide de l’immunohistochimie, puis quantifiées sur l’épaisseur du tissu à l’aide de la technique du fractionneur optique.

Protocol

Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’examen éthique des animaux approprié.

1. Traitement des tissus

< span style='famille-de-police :Arial,sans-serif ;taille-de-police :12pt ;style-de-police :normal ;variant-de-police :normal ;décoration-de-texte :aucun ;alignement vertical :ligne de base ;espace-blanc :pré-enveloppé ;'>REMARQUE : Après la perfusion transcardique et la postfixation dans du paraformaldéhyde à 4 % (PFA) dilué dans un tampon phosphate à 0,2 M pendant la nuit à 4 °C, les cerveaux sont transférés à 30 % de saccharose dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pendant trois jours à 4 °C. Après cela, les cerveaux sont congelés sur de la glace carbonique en poudre et stockés à -80 °C jusqu’à la section.

1. Séparez les hémisphères droit et gauche le long de la ligne médiane du cerveau à l’aide d’un scalpel. Ensuite, choisissez l’un ou l’autre hémisphère au hasard dans le premier cerveau. Ensuite, décalez systématiquement entre les hémisphères droit et gauche (Figure 1A). Montez l’hémisphère échantillonné sur un disque d’échantillon avec l’axe long perpendiculaire au disque à l’aide d’un support de montage.
2. Placez des récipients multi-plats numérotés pour le pré-refroidissement dans le cryostat.
3. Montez le disque de l’échantillon dans le cryostat et coupez l’intégralité de l’hippocampe (Bregma 1,80 à - 7,04) en sections de 80 μm d’épaisseur dans le plan coronal (Figure 1B).
   1. Place toutes les sections échantillonnées consécutivement dans les conteneurs multi-plats refroidis pour maintenir les sections dans l’ordre de coupe.
   2. Couvrez complètement les sections avec un cryoprotecteur et maintenez les récipients à -20 °C jusqu’à une utilisation ultérieure.

2. Immunocoloration

REMARQUE : Pour garder une trace des sections individuelles tout au long de la procédure de coloration, placez les sections échantillonnées dans des filets de coloration à 25 puits. Utiliser toutes les 5 sections, ce qui donne un nombre final moyen de 12 (8-16) sections par hippocampe pour l’immunocoloration et le comptage cellulaire ultérieur.

1. Avant de sous-échantillonner chaque nième section avec un début aléatoire entre les sections un et n (Figure 1C), transfère les conteneurs de -20 °C à température ambiante (RT).
2. Utilisez un pinceau, par exemple, pour transférer les sections par ordre numérique vers les filets de coloration à 25 puits placés dans des boîtes de Pétri remplies de solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
   REMARQUE : À partir de ce point, conservez les sections dans les filets de coloration placés dans des plats en verre assortis sur un agitateur orbital (sections 2.3 à 2.9).
3. Transférez les filets de coloration dans la vaisselle en verre assortie et lavez les sections deux fois pendant 10 min dans du PBS à température ambiante (RT) avant l’incubation dans du peroxyde d’hydrogène à 3 % (H₂O style='font-family :Arial,sans-serif ;font-size :0.6em ;font-style :normal ;font-variant :normal ;font-weight :400 ;text-decoration :none ;vertical-align :baseline ;white-space :pre-wrap ;'>₂) dilué dans de l’eau distillée (dH₂O) pendant 20 min.
4. Transférer les sections dans trois solutions différentes d’acide chlorhydrique (HCl) (1 M à 0 °C pendant 10 min, 2 M à RT pendant 10 min et 2 M à 37 °C pendant 20 min) avant de neutraliser dans du tétraborate de sodium 0,1 M à RT pendant 20 min.
5. Après 3 × 10 min d’incubation dans du Triton X-100 à 1 % dilué dans du PBS (tampon de lavage), transférer les sections dans un tampon de lavage contenant 10 % de sérum de veau fœtal (solution bloquante) pendant 1 h à RT.
6. Incuber les sections pendant 48 h à 4 °C dans de l’anti-BrdU de souris (5-bromo-2'-désoxyuridine) dilué 1:100 dans une solution bloquante.
7. Laver les sections 3 × 10 min dans un tampon de lavage et incuber pendant 48 h dans de la peroxydase de raifort diluée 1:10 dans un tampon de lavage.
8. Transférez les sections sur PBS pendant 5 × 10 min, puis pendant 7 min dans de la diaminobenzidine (DAB) à 0,01 % diluée dans du PBS avant d’être transférées dans une solution DAB similaire contenant 0,02 % de H₂O style='font-family :Arial,sans-serif ;font-size :0.6em ;font-style :normal ;font-variant :normal ;font-weight :400 ;text-decoration :none ;vertical-align :baseline ;white-space :pre-wrap ;'>₂ pendant 10 min à RT.
9. Effectuez une série de lavages (2 × 10 min dans du PBS et 2 × 10 min dans un tampon phosphate sans chlorure de sodium ajouté) et montez les coupes par ordre numérique sur des lames de microscope.
10. Séchez les sections pendant environ 30 minutes avant de contre-colorer avec du violet de crésyle.
11. Placez les lames de microscope dans un support de diapositives.
12. Réhydratez les sections pendant 10 min dans des plats de coloration de diapositives contenant dH₂O, puis transférez les diapositives à 0,02 % de violet crésyle en dH₂O pendant 15 min.
13. Répétez l’étape 2.12 avant de déshydrater les sections trois fois dans de l’éthanol (96 % pendant 5 minutes et 99 % pendant 2 × 2 minutes).
14. Placez les sections dans du xylène pendant 2 × 15 minutes et glissez les lames à l’aide d’un milieu à séchage rapide pour le montage.
15. Enfin, laissez les lames recouvertes pendant environ 24 h avant de pouvoir être utilisées pour la microscopie.

3. Estimation du nombre total de neurones étiquetés BrdU à l’aide du fractionneur optique

REMARQUE : Réalisez une étude pilote qui inclut quelques animaux pour déterminer les paramètres d’échantillonnage optimaux, tels que le nombre de sections à analyser et le nombre de dissections optiques dans les sections échantillonnées. Ce pilote fournit également un CV préliminaire (écart-type/moyenne) et la possibilité d’ajuster le CE pour obtenir une précision satisfaisante des estimations déterminées par l’investigateur (pour plus de détails, voir ci-dessous). De même, une analyse de distribution z abordera les points suivants : le rétrécissement des tissus, la qualité de la coloration dans toute la section et la distribution des cellules dans l’axe z.

1. Vérifiez l’épaisseur du tissu dans les sections pour confirmer qu’elles sont adaptées à l’utilisation du fractionneur optique, par exemple, assez épaisses pour la hauteur du dissecteur choisi, y compris les zones de garde (voir ci-dessous). NOTE : L’épaisseur du tissu est mesurée à plusieurs endroits dans la région d’intérêt.
   1. Place les lames sur la platine motorisée du microscope et allume le logiciel stéréologique préféré.
   2. Délimitez la zone d’intérêt à l’aide d’un objectif à faible grossissement (2X ou 4X) avant de passer à un objectif à immersion à l’huile 100X (voir Figure 2A).
   3. Utilisation d’un point spécifique d’un cadre de comptage (e.g., au niveau ou à proximité d’un coin), localisez le haut de la section en vous déplaçant le long du plan focal jusqu’à ce qu’une caractéristique de la section apparaisse nette. Enregistrez cette position z comme 0 (voir Figure 2B).
   4. Déplacez le plan focal vers le bas à travers le tissu jusqu’à ce que le même point spécifique du cadre de comptage se trouve au dernier niveau z du tissu net et marquez cette position. L’épaisseur locale du tissu est définie de 0 à cette extrémité et peut être lue sur l’axe z. Enregistrez l’épaisseur du tissu (voir Figure 2B).
2. Documentez la pénétration complète de la coloration et la répartition des cellules dans toute l’épaisseur de la section.
   REMARQUE : La distribution des neurones marqués par BrdU est utilisée comme guide pour déterminer les zones de garde requises. Bien qu’une distribution uniforme des cellules soit essentielle, il est acceptable d’observer moins de cellules près du haut et du bas de la section, ce qui indique l’effet de la perte des capuchons.
   1. Échantillonnez des neurones étiquetés BrdU et enregistrez leur position z avec l’épaisseur de la section locale mesurée dans le coin sélectionné de chaque cadre de comptage.
   2. Tracez le nombre de neurones BrdU-positifs en fonction de leur position z.
3. La hauteur du directeur et des zones de garde doit être fixée en fonction de l’épaisseur moyenne de la section et de la distribution des cellules (voir 3.1 et 3.2).
   NOTE : La hauteur du dissecteur doit être inférieure à l’épaisseur de la section pour éviter les artefacts à proximité des surfaces. Ce risque est contourné en incluant des zones de garde en haut et en bas de la section.
4. Déterminez la longueur de pas entre les dissecteurs.
   1. Délimitez la région d’intérêt sur toutes les sections à analyser et enregistrez les zones.
   2. Additionnez ces zones et divisez par le nombre de dissecteurs placés dans cette zone.
      NOTE : Sur la base de l’expérience précédente, un bon point de départ implique 75 sondes. Cela permettra d’approximer la zone et les positions d’échantillonnage correspondantes (A_step).
   3. Prenez la racine carrée de A_step, qui fournira la taille x-y-step.
5. Déterminez la taille du cadre de comptage.
   1. Réglez la taille du cadre de comptage à une unité arbitraire et effectuez un échantillonnage pilote de neurones positifs à BrdU en utilisant les paramètres obtenus dans les sections 3.3 et 3.4.
      NOTE : La taille doit être déterminée empiriquement par essais et erreurs, mais il est recommandé de l’ajuster pour permettre l’échantillonnage de 2 à 3 cellules par dissecteur.
6. Après cette dernière étape de l’étude pilote, commencer l’échantillonnage cellulaire.
   REMARQUE : Les paramètres d’échantillonnage obtenus devraient permettre d’obtenir un comptage d’environ 150 à 200 cellules chez chaque animal, ce qui est suffisant pour obtenir une conception stéréologique efficace.
7. Comptez les neurones positifs à BrdU à l’aide d’un objectif à immersion dans l’huile de 100× et d’un grossissement final de 2000 à 3000×. Dans chaque dissecteur optique, identifiez tous les neurones marqués par BrdU qui sont reconnus par la caractéristique d’intérêt (dans la présente étude, le critère est le moment où le bord d’attaque du neurone marqué par BrdU devient focalisé pour la première fois), sont situés à l’intérieur du cadre de comptage ou touchent les lignes d’inclusion (Figure 2B). Ne comptez pas les neurones BrdU-positifs qui touchent les lignes d’exclusion lorsqu’ils sont clairement reconnus par la caractéristique d’intérêt à l’intérieur de la hauteur du dissecteur. Il est extrêmement important de suivre attentivement ces règles de comptage tout au long de la quantification stéréologique.
   NOTE : Comme BrdU s’incorpore dans toutes les cellules en division, la morphologie fait la distinction entre les neurones et les autres types de cellules. Les caractéristiques des neurones sont un noyau clairement défini avec un cytoplasme neutre et un nucléole sombre. Les cellules BrdU-positives sont reconnues comme des neurones nouvellement formés en raison de leur taille plus grande que les cellules gliales. Dans les études de prolifération à court terme (par exemple, < 2,4 h), une double coloration à l’aide de marqueurs neuronaux immatures peut être une condition préalable.

Results

Materials