1. Fluorescence Imaging
- Image le Drosophila nymphale à l’aide d’un microscope fluorescent. Toutes les 7 min, capturer des coupes en série à travers le domaine apical du neuroépithélium de l’œil, dans la région des jonctions adhérentes.
NOTE : a) Les sections série appropriées sont généralement de 4 à 5 par pile z, composée de pas z de 0,2 μm. b) Des irrégularités dans la topologie de l’épithélium, y compris de légères bosses et plis, peuvent rendre difficile l’acquisition d’images nettes de grandes régions de tissus. Lors de l’imagerie, on peut constater qu’une partie d’une zone d’intérêt est mise au point et qu’une région voisine est floue. L’inclusion d’une petite gouttelette d’eau distillée entre l’œil de la nymphe et la lamelle peut éliminer certains plis tissulaires aigus, mais pas la topologie légèrement inégale caractéristique des premiers stades de la morphogenèse de l’œil nymphal. Dans ces cas, suréchantillonnez le tissu en étendant la pile z jusqu’à ce que des tranches nettes soient acquises pour l’ensemble du champ. c) La capture de coupes en série toutes les 7 minutes devrait permettre une imagerie en direct pendant 3 à 4 heures sans réduction significative de l’intensité de la fluorescence de la protéine fluorescente verte (GFP) qui pourrait compromettre la qualité de l’image. Des intervalles de temps plus courts peuvent réduire la durée totale de l’imagerie. - Continuez l’imagerie pendant 3 à 4 heures. N’utilisez pas une fonction de mise au point et de temps automatique qui est disponible sur de nombreux microscopes fluorescents, car la croissance nymphale et le pompage de l’hémolymphe déplacent la position de la rétine et une refocalisation vigilante est nécessaire toutes les 14 à 21 minutes.
NOTE : L’imagerie au-delà de 4 heures peut ralentir ou retarder la morphogenèse de l’œil.
- Utilisez un logiciel de déconvolution approprié pour réduire l’arrière-plan et améliorer le contraste des images de la section série. Pour chaque fichier z-stack, procédez comme suit dans le logiciel LAS AF (Advanced Fluorescence) de la suite d’applications Leica : Accédez au panneau Outils, sélectionnez Déconvolution 3D, puis cliquez sur Appliquer.
- Générer une image de projection maximale (MP) pour chaque fichier de pile déconvoluté : accédez au panneau Outils, sélectionnez Projection 3D et cliquez sur Appliquer.
REMARQUE : L’algorithme MP peut ne pas générer une image uniformément nette pour les tissus qui ont été suréchantillonnés.
2. Image Processing
- Alignement automatique de l’image :
REMARQUE : The live Drosophila tissu se déplacera et grandira tout au long du processus d’imagerie. Par conséquent, les centres des images rassemblées à des points temporels successifs peuvent ne pas correspondre au même point dans l' Drosophila tissu. De plus, l’ensemble du disque rétinien tourne d’environ 30° entre ~21 et 23 heures après la formation du puparium (APF). Pour mettre en évidence les comportements cellulaires individuels et réduire les distractions causées par la croissance de l’organisme, alignez chaque image MP. Bien que cela puisse être effectué manuellement, le logiciel d’édition d’images utilisé ici dispose d’algorithmes intégrés qui peuvent accélérer le processus.
- Depuis l’onglet Fichier du menu principal, ouvrez Scripts et sélectionnez Charger les fichiers dans la pile.
- Importez les fichiers d’image MP dans le panneau Charger les calques et sélectionnez OK. Assurez-vous que l’option Tentative d’alignement des images sources n’est pas sélectionnée automatiquement.
- : Si cette option est sélectionnée, le logiciel peut utiliser un algorithme d’alignement qui déforme les données de l’image.
- Une fois que tous les fichiers MP ont été chargés dans le volet Calques, assurez-vous que toutes les images sont dans l’ordre chronologique de sorte que le point le plus ancien se trouve en haut de la pile de calques. Si les calques ne sont pas dans le bon ordre, faites-les glisser et déposez-les jusqu’à ce qu’ils soient correctement ordonnés.
- Sélectionnez Aligner automatiquement les calques dans l’onglet Modifier du menu principal. Choisissez Repositionner et cliquez sur OK.
- Si l’algorithme d’alignement automatique ne parvient pas à orienter les images vers un point focal approprié, effectuez des ajustements mineurs à l’aide de l’outil Déplacer.
