Imagerie longitudinale à deux photons de neurones marqués par fluorescence dans l’hippocampe d’une souris vivante

Résumé

Source : Ulivi, A. F., et. al. Imagerie longitudinale à deux photons de l’hippocampe dorsal CA1 chez des souris vivantes. J. Vis. exp. (2019)
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p style='line-height :1.380000000000001 ;margin-bottom :0pt ;margin-top :0pt ;text-align :justify ;' dir='ltr'>Cette vidéo fait la démonstration de l’imagerie longitudinale à deux photons de neurones pyramidaux marqués par fluorescence chez une souris vivante, montrant la préparation, l’alignement des canules et l’imagerie des dendrites et des épines dendritiques pour étudier la structure neuronale dans la région CA1 de l’hippocampe.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Préparation de la séance d’imagerie
2. Allumez la configuration d’imagerie à l’avance et laissez le laser se réchauffer et se stabiliser, si nécessaire.
3. Anesthésie la souris. Placez la souris dans la chambre d’induction de l’anesthésie à 3 % d’isoflurane dans 1 L/min O₂ et attendez qu’elle perde conscience. Évaluez l’anesthésie à l’aide du test du réflexe de pincement des orteils.
4. À l’aide d’une pince, retirez soigneusement le film adhésif de la plaque du support de tête. Tenez la souris dans une main et la plaque de support de tête avec les doigts. Retirez le film délicatement, pour éviter d’endommager la préparation.
5. Placez la souris sous le microscope, au-dessus du tapis chauffant et fixez la plaque de tête au support (Figure 1D).
6. Positionnez le cône nasal de manière à couvrir le museau et diminuez l’isoflurane à 1,5-2 %.
7. Appliquez une pommade ophtalmique sur les yeux de la souris.
8. Nettoyez la canule d’imagerie en la rinçant à l’eau déminéralisée. Utilisez une seringue et une aiguille fine pour déposer de l’eau dans la canule et une pompe à vide pour l’enlever.

2. Séance d’imagerie

1. Utilisez des objectifs à faible grossissement et à longue distance de travail pour vérifier visuellement la canule pour détecter l’eau résiduelle, la saleté, l’intégrité et la présence de fluorescence.
2. Alignez la canule sur l’axe optique en ajustant les angles des bras du porte-tête.
3. Passez aux objectifs à immersion dans l’eau 25X 1,0 NA (ouverture numérique), WD 4 mm (distance de travail) ou 40X 0,8 NA, WD 3 mm. Ajoutez suffisamment d’eau déminéralisée pour remplir la canule et maintenez l’excès d’eau sur le dessus de la canule. Évitez la formation de bulles d’air.
4. Utilisez l’excitation à deux photons (2P) et des signaux fluorescents d’image.
   REMARQUE : Le protocole d’imagerie dépend fortement des échelles de temps et spatiales à imager. Veuillez vous référer aux résultats représentatifs de la section et à la discussion pour plus de détails sur les paramètres d’imagerie que nous avons utilisés pour produire les images présentées dans cet article.

Résultats

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Matériaux