Étude de l’origine des neurones sensoriels dans la dure-mère à l’aide de la microscopie à fluorescence

Résumé

Source : Wang, J., et al. Visualisation de l’innervation immunoréactive du peptide lié au gène de la calcitonine de la dure-mère crânienne du rat avec immunofluorescence et traçage neural. J. Vis. exp. (2021).

Cette vidéo présente une méthode permettant de retracer l’origine des neurones sensoriels dans la dure-mère à l’aide de la microscopie à fluorescence. Un traceur rétrograde est introduit dans la dure-mère exposée d’un rat anesthésié. Le traceur est absorbé par les axones neuronaux sensoriels et se déplace rétrogradamment vers leurs corps cellulaires au sein du ganglion trijumeau et des ganglions de la racine dorsale cervicale. Les ganglions sont ensuite sectionnés, colorés avec des anticorps qui marquent le traceur et les neuropeptides dans les corps cellulaires, et analysés à l’aide de la microscopie à fluorescence pour confirmer les origines ganglionnaires des neurones sensoriels.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le vétérinaire JoVE. Commission d’examen.

1. Étude de traçage rétrograde avec fluorogold (FG)

1. Interventions chirurgicales
   1. Déterminez la zone de coordonnées d’intérêt dans la dure-mère crânienne du rat.
   2. Préparez une micro-seringue de 10 μL et testez-la avec de la paraffine liquide.
   3. Anesthésier les rats avec une solution de tribromoéthanol (150 mg/kg) par injection intrapéritonéale. Vérifiez la profondeur de l’anesthésie par l’absence de réponse au pincement des orteils.
   4. Rasez la tête du rat avec un rasoir électrique.
   5. Mettez des barres d’oreille émoussées sur le rat et placez-le sur l’appareil stéréotaxique. Ensuite, mettez le support buccal et appliquez une pommade ophtalmique sur les yeux.
   6. Nettoyez le site chirurgical de la peau de la tête avec de la povidone iodée à 10 % suivie d’éthanol à 75 %.
   7. Faites une incision le long de la ligne médiane du cuir chevelu.
   8. Retirez émoussé le périoste et les tissus musculaires du crâne à l’aide d’applicateurs stériles à embout de coton (Figure 1A).
   9. Percez un petit trou (~5-7 mm) à l’aide d’une perceuse à meules avec un embout à bout rond (#106) sur les os pariétals et temporaux gauches au-dessus de l’artère méningée moyenne (MMA), et assurez-vous que la dure-mère crânienne a été conservée intacte (Figure 1B).
   10. Construisez une banque autour du trou avec du ciment silicate dentaire pour limiter la propagation du traceur (Figure 1C).
   11. Ajoutez 2 μL de FG à 2 % dans le trou autour du MMA avec une micro-seringue de 10 μL (Figure 1D).
   12. Couvrez le trou avec un petit morceau d’éponge hémostatique.
   13. Mettez un morceau de film de paraffine sur le trou et scellez les bords avec de la cire d’os pour éviter la fuite de traceur et pour éviter de contaminer les tissus environnants.
   14. Suturez la plaie avec du fil stérile.
   15. Gardez les rats dans un endroit chaud jusqu’à ce qu’ils soient complètement rétablis.
   16. Remettez les rats dans leurs cages et ajoutez un antibiotique et un analgésique dans l’eau de boisson.
2. Perfusions et sections
   1. Après 7 jours de survie, perfrez ces rats.
   2. Disséquez le ganglion du trijumeau (TG) et les ganglions de la racine dorsale C1-4 (DRG), puis post-fixez-les et cryoprotégez-les (Figure 1F).
   3. Découpez les TG et DRG à l’épaisseur de 30 μm sur un système de microtome cryostat dans le sens sagittal et montés sur des lames de verre recouvertes de silane.
3. Double immunofluorescence pour le marquage des peptides liés au gène FG et à la calcitonine (CGRP) dans les TG et DRGs
   REMARQUE : Bien que l’étiquetage FG puisse être observé directement avec un éclairage ultraviolet (UV) sous une lampe au mercure sans coloration supplémentaire, les neurones marqués avec FG ont été examinés plus en détail dans les DRG TG et cervicaux en utilisant des immunofluorescences doubles avec FG et CGRP pour révéler les origines de la CGRP-immunoréactive durale fibres nerveuses dans les TG et DRG.
   1. Encerclez les sections avec le stylo histochimique.
   2. Incuber les sections pendant 30 min dans une solution bloquante contenant 3 % de sérum d’âne normal et 0,5 % de Triton X-100 dans un tampon phosphate (PB) de 0,1 M.
   3. Transvaser les échantillons dans la solution d’anticorps anti-fluorogold de lapin (1:1000) et d’anticorps anti-CGRP de souris (1:1000) dans 0,1 M PB contenant 1 % de sérum d’ânesse normal et 0,5 % de Triton X-100 pendant la nuit à 4 °C.
   4. Lavez les sections trois fois en 0,1 M PB le lendemain.
   5. Incuber dans une solution mixte d’anticorps anti-âne anti-lapin Alexa Fluor 594 (1:500) et d’anticorps anti-âne anti-souris Alexa Fluor 488 (1:500) dans 0,1 M PB contenant 1 % de sérum d’âne normal et 0,5 % de Triton X-100 pendant 1,5 h à température ambiante.
   6. Lavez et appliquez des lamelles sur les sections.
4. Observation et enregistrement
   1. Prenez des images des neurones marqués FG dans les TG et DRG sous éclairage UV par microscope fluorescent équipé d’un appareil photo numérique.
   2. Capturez des images des neurones marqués FG et CGRP dans les TG et DRG sous un microscope fluorescent équipé d’un appareil photo numérique.
   3. Utilisez le logiciel de retouche pour régler la luminosité et le contraste des images et pour ajouter des étiquettes dans les images.

Résultats

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Alexa Fluor 488 âne anti-souris IgG (H+L)	Invitrogen by Thermo Fisher Scientific	A21202	Protéger de la lumière ; RRID : AB_141607
Instrument de stéréotaxie cérébrale	Narishige	SR-50
CellSens Dimension	Olympus	Version 1.1	Software of fluorescent microscope
Fluorogold (FG)	Fluorochrome	52-9400	Protéger de la lumière
Système d’imagerie fluorescente	Olympus	BX53
Microtome gelant	Thermo	Microm InternationalGmbH
Micro Drill	Saeyang Microtech	Marathon-N7
Souris anti-CGRP	Abcam	ab81887	RRID : AB_1658411
Sérum d’âne normal	Jackson ImmunoResearch	017-000-121
Phalloidin 568	Sondes moléculaires	A12380	Protéger de la lumière
Photoshop et illustration	Adobe	CS6	logiciel de retouche photo
Rabbit anti- Fluorogold	Abcam	AB153	RRID : AB_90738
Sprague Dawley	Instituts nationaux de contrôle des aliments et des drogues	SCXK (JING) 2014-0013
lames de microscope Superfrost plus	Thermo	#4951PLUS-001	25x75x1mm