Surveillance de la récupération de cellules interneuromastiques ablatées au laser chez le poisson-zèbre à l’aide de la microscopie confocale

Résumé

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p style='hauteur-de-ligne :1.2 ;margin-bottom :0pt ;margin-top :0pt ;' dir='ltr'>Source : Volpe, B. A., et al. Essai d’ablation et de régénération laser basé sur un microscope confocal dans les cellules interneuromastères du poisson-zèbre. J. Vis. Exp. (2020)

Cette vidéo démontre la surveillance de la récupération des cellules interneuromastes chez le poisson-zèbre à l’aide de la microscopie confocale, le suivi de la mort et de la réparation cellulaires grâce à Imagerie par fluorescence en accéléré.

Protocole

1. Imagerie post-ablation et microscopie time-lapse pour étudier la régénération

1. Cliquez sur le menu déroulant pour « Channels ». Dans les canaux, décochez la piste « DAPI"(4′,6-diamidino-2-phénylindole) pour désactiver le laser d’ablation. Cliquez sur le menu déroulant pour « Mode d’acquisition ».
2. En mode acquisition, cliquez sur « Zoom ».
3. Réduisez le zoom à 0,7 soit à l’aide du curseur, soit en tapant « 0.7."
   1. Pour garantir une ablation cellulaire réussie, augmentez le gain à 900 et balayez rapidement le champ de vision.
      REMARQUE : Aucune GFP (protéine fluorescente verte) ne doit être visible dans la ou les cellules ciblées. En utilisant des paramètres identiques ou similaires à ceux décrits pour l’imagerie avant l’ablation, capturez et enregistrez une image après l’ablation (Figure 1C). Si l’image révèle des restes de cellules fluorescentes ou des corps cellulaires supplémentaires qui doivent être retirés, répétez les étapes d’ablation au laser pour créer un espace visible dans la chaîne de cellules interneuromastomastiques.
   2. Inspectez l’image du canal T-PMT (Transmission Photomultiplier Tube) pour confirmer davantage les dommages cellulaires. Les cellules endommagées auront un aspect granuleux, et les noyaux gonfleront ou deviendront fréquemment de forme irrégulière (Figure 2).
4. Après avoir capturé une image de pré-ablation, ablaté les cellules si nécessaire et capturé une image post-ablation pour chaque position de platine individuelle, configurez la microscopie time-lapse en activant les options de position de platine et de temps pour la capture d’image. Réglez les paramètres de temps sur 24 h ou un autre point final souhaité et des intervalles de 15 minutes. Lancez l’expérience pour acquérir des images et enregistrez le fichier résultant une fois terminé (le lendemain).
5. Si les larves doivent être étudiées ou élevées plus en profondeur, retirez-les soigneusement de l’agarose à l’aide d’une pince fine, puis transférez-les dans un milieu E3 sans tricaïne pour les récupérer. S’ils ne doivent pas être utilisés davantage, euthanasier selon le protocole approuvé pour les animaux (l’immersion rapide et soutenue dans un bain de glace est une méthode courante) et les éliminer selon les exigences de l’établissement.

Résultats

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
12-well PTFE Printed Slides	Sciences de la microscopie électronique	63425-05
15 mM Tricaine stock solution	Sigma	E10521	15 mM Tricaine in reverse osmosis water
1X E3 + 600 μM Tricaine			Diluer 15 mM Tricaine stock 25X dans 1X support E3
1X E3 media	<	Diluez 60X le média E3 à 1X dans de l’eau d’osmose inverse (16.7 ml/L)
60 X E3 media	Tous les composants achetés chez Sigma-Aldrich	<
Bx60 Microscope composé avec fluorescence de lampe à arc au mercure	Olympus
LSM 700 microscope confocal équipé de lasers de 405 nm, 488 nm et 555 ou 561 nm	Carl Zeiss Microscopy, LLC		Un laser de 5 mW 405 nm a été utilisé pour l’ablation ; Les ablations et l’imagerie ont été effectuées à l’aide d’un objectif Plan-Apochromat 63x avec une NA de 1,40
FIJI/ImageJ Logiciel de traitement d’image	Plusieurs contributeurs		Téléchargeable à https://fiji.sc/
Aiguille de dissection modifiée en couteau à cheveux	Fisher Scientific	19010	Un cil a été collé sur l’extrémité d’une aiguille de dissection à manche en bois
Logiciel Microsoft Excel	Microsoft Corp.	<
Plats en verre de 35 mm avec lamelle n° 1,5, fenêtre de 20 mm<	P35G-1.5-20-C	Boîte de Pétri de 35 mm, fenêtre en verre de 20 mm
Immersol 518F Immersion Oil	Fisher Scientific	12-624-66A
Low Gelling Agarose	Sigma Life Science	A9414-256
Insert Corning Netwell avec maille polyester de 74 um, insert de 24 mm	Millipore Sigma	CLS3479-48EA
Rstudio software	Rstudio PBC		Téléchargeable à https://rstudio.com/
SMX-168-BL Stéréomicroscope	Motic		<
Transfer Pipette	Fisher Scientific	13-711-7M
ZEN software	Carl Zeiss Microscopy, LLC	<

< style='height :20px ;' >style='débordement :caché ;rembourrage :0px 3px ;alignement vertical :bas ;'> td style='famille-police :Roboto ;taille-de-police :7pt ;poids-police :normal ;débordement :caché ;rembourrage :0px 3px ;alignement-vertical :bas ;espace-blanc :normal ;word-wrap :break-word ;wrap-strategy :4 ;'>34.4 g Nacl, 1.52 g Kcl, 5.8 g CaCl2.2H2O, 9.8 g MgSO4.7H20 dans 1 litre d’eau d’osmose inversetd style='famille-de-police :Roboto ;taille-de-police :7pt ;poids-de-police :normal ;débordement :caché ;rembourrage :0px 3px ;alignement-vertical :bas ;espace-blanc :normal ;word-wrap :break-word ;wrap-strategy :4 ;'>Google sheets est une alternative gratuite à Microsoft Exceltd style='font-family :Roboto ;font-size :7pt ;font-weight :normal ;overflow :hidden ;padding :0px 3px ;vertical-align :bottom ;white-space :normal ;word-wrap :break-word ;wrap-strategy :4 ;'>Mattek Corporationtr style='hauteur :20px ;' >td style='overflow :hidden ;padding :0px 3px ;vertical-align :bottom ;'>