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Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par l’examen éthique animal approprié comité.
1.Prepare Tampon Krebs modifié.
Fais un tampon Krebs modifié de telle sorte que les concentrations finales (en mM) des composants soient les suivantes : 121 NaCl, 5.9 KCl, 2.5 CaCl2, 1.2 mgCl2, 1.2 NaH2PO4, 10 HEPES, 21.2 NaHCO3, 1 acide pyruvique et 8 glucose (pH ajusté à 7,4 avec NaOH). Ajoutez 3 μM de nicardipine et 1 μM de scopolamine pour inhiber les contractions musculaires pendant Ca2+ l’imagerie et les dissections entières.
2. Imagerie et analyse
REMARQUE : Utilisez au moins un appareil d’imagerie de base avec une source de lumière fluorescente, un microscope, une caméra CCD de qualité et un logiciel d’acquisition approprié. Variez l’ajout d’autres composants en fonction de la source lumineuse et de l’application spécifique. Une roue à filtres et un obturateur doivent être utilisés avec une source lumineuse à arc au xénon traditionnelle. Cependant, les sources lumineuses LED et les systèmes d’éclairage n’ont pas besoin de ces composants.
- Positionnez la chambre d’enregistrement sous le microscope et, à l’aide d’un système de perfusion par gravité avec plusieurs réservoirs de seringue chauffés, établissez un taux de perfusion continu de 2–3 ml/min de tampon Krebs à 37 °C. Assurez-vous d’éviter la formation de bulles d’air dans la conduite d’entrée et d’aspiration reliée à un piège à vide.
- Faites la mise au point sur le plexus souhaité sous un éclairage en champ clair. Évitez de surexposer les tissus, ce qui pourrait entraîner un photoblanchiment.
- Examinez la charge de Fluo-4 dans les ganglions et sélectionnez des ganglions sains pour l’imagerie. Les ganglions malsains/endommagés présenteront une autofluorescence ou une morphologie ponctuée et ne doivent pas être utilisés pour l’imagerie.
- Une fois le ganglion sélectionné, dévier le chemin de la lumière vers la caméra et obtenir une image en direct avec un logiciel d’acquisition d’images. Assurez-vous que le ganglion est net et réglez le taux d’acquisition d’image et les temps d’exposition.
REMARQUE : Les taux et les temps d’acquisition des images varient en fonction des événements que les enquêteurs souhaitent enregistrer. Pour la plupart des expériences, les images sont traditionnellement acquises à 0,5-1 Hz pour les cellules gliales et jusqu’à 2-10 Hz pour les neurones car glial Ca2+ réponses ne sont pas aussi rapides que Ca2+ transitoires dans les neurones. - Commencer l’expérience et établir l’activité de base pendant 30 secondes.
- Appliquez des médicaments d’intérêt préchauffés tels que des agonistes et des antagonistes des récepteurs à l’aide du système de perfusion par gravité à une vitesse de 2-3 ml/min. Après l’application des agonistes/antagonistes en revenant à une perfusion de tampon normal et laissez une période de lavage/récupération d’au moins 10 min.
NOTE : Les délais d’application du médicament varient en fonction du composé individuel et de la conception expérimentale. En général, une application de 20 à 30 secondes d’agoniste est suffisante pour activer les récepteurs couplés aux protéines G dans les neurones et les cellules gliales. Cependant, les canaux ioniques ligand-dépendants (tels que les récepteurs nicotiniques de l’acétylcholine) nécessitent des temps d’application ne dépassant pas 5 à 10 secondes. Des expositions de plus longue durée entraîneront une désensibilisation rapide des canaux ioniques ligand-dépendants. Les antagonistes doivent être appliqués pendant environ 3 à 15 minutes pour assurer le blocage complet des voies réceptrices. Cependant, il s’agit d’une généralisation grossière et les chercheurs devraient toujours optimiser tout médicament expérimental dans leur paradigme particulier. - Arrêtez l’enregistrement et visionnez la vidéo en accéléré de l’expérience. Sélectionnez soigneusement les régions d’intérêt (ROI) à l’aide du logiciel d’analyse d’images approprié.
- Utilisez un logiciel pour normaliser et comparer l’intensité fluorescente du retour sur investissement par rapport à sa valeur fluorescente de référence initiale. Les changements de fluorescence normalisée sont directement proportionnels aux changements de [Ca2+].
- Utilisez une modification d’une méthode décrite précédemment en utilisant ΔF/F = ((F1− F0)/F0)ROI − ((F1− F0)/F0)background, où F1 est la fluorescence en un point donné et F0 est la fluorescence de base, pour améliorer la précision de l’évaluation. Cette modification aide à réduire le bruit des changements de fluorescence dans les préparations tissulaires qui présentent le mouvement de la couche musculaire sous-jacente au plexus myentarique.