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Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.
1. Remplissage d’astrocytes avec l’ionophorèse
- Testez l’électrode.
- Placez délicatement une tranche de cerveau dans un plat à fond de verre rempli de 0,1 M PBS à température ambiante. Maintenez la tranche en place avec une harpe platine avec des cordes en nylon.
- Assurez-vous que l’électrode est connectée à une source de tension et placez l’électrode de terre dans le bain contenant la tranche de cerveau.
- Déplacez l’objectif vers la région cérébrale d’intérêt.
- Abaissez l’électrode dans la solution. Sous le champ clair, déplacez-le au centre du champ de vision et examinez-le soigneusement avec l’objectif d’immersion dans l’eau 40x pour vous assurer qu’il apparaît clair et sans débris ni bulles. S’il y a quelque chose qui obstrue l’embout de l’électrode, remplacez-le par un nouveau.
REMARQUE : Le colmatage est un problème pour l’électrode de 200 MΩ. Avec la centrifugation et la filtration de la solution de colorant avant chaque expérience, cela ne devrait pas être un problème fréquent. Cependant, comme l’extrémité de l’électrode est petite, du tissu peut parfois se coincer dans l’ouverture. Les auteurs n’ont pas trouvé de moyen d’empêcher cela, mais il peut être facilement traité en utilisant simplement une nouvelle électrode. - Sous le champ clair, abaissez lentement l’électrode vers la tranche en vous arrêtant juste au-dessus de la surface.
- Remplissez l’astrocyte avec de l’ionophorèse.
- Identifiez les astrocytes à 40-50 μm sous la surface de la coupe avec le contraste interférentiel différentiel infrarouge (IR-DIC). Recherchez des cellules avec des somates allongés de forme ovale d’environ 10 m de diamètre. Une fois qu’un astrocyte est choisi, déplacez-le au centre du champ de vision.
REMARQUE : Une bonne cellule pour l’ionophorèse a des bordures claires et définies autour d’elle. Ne choisissez pas de cellules trop proches de la surface de la tranche car elles ne peuvent pas être complètement remplies. Il faut un peu de pratique pendant quelques jours pour être en mesure d’identifier régulièrement les astrocytes pour le remplissage des colorants. Selon la zone du cerveau utilisée pour l’expérience, le nombre d’astrocytes peut varier. Cela peut affecter le temps nécessaire pour identifier un astrocyte avant le remplissage. - Abaissez lentement la pointe de l’électrode dans la tranche, en naviguant à travers le tissu, jusqu’à ce qu’elle soit sur le même plan que le corps cellulaire.
REMARQUE : Déplacez l’électrode lentement pour éviter d’endommager les tissus. - Une fois que le corps cellulaire de l’astrocyte est clairement visible et délimité, faites avancer lentement et doucement l’électrode. Déplacez l’électrode jusqu’à ce que l’extrémité empale le soma de la cellule. Déplacez lentement la mise au point de l’objectif vers le haut et vers le bas pour noter si l’électrode est à l’intérieur du soma.
REMARQUE : L’embout de l’électrode doit être à l’intérieur du corps de la cellule, et une petite indentation sur le soma doit être observée. Ne déplacez pas l’électrode plus loin pour éviter que la pointe ne traverse la cellule. - Une fois que la pointe de l’électrode est à l’intérieur de la cellule, allumez le stimulateur à ~0,5−1 V et éjectez continuellement le courant dans la cellule. À l’aide du microscope confocal, observez le remplissage de la cellule. Augmentez le zoom numérique pour voir les détails de la cellule et assurez-vous que la pointe de l’électrode est visible à l’intérieur de la cellule.
REMARQUE : Baissez la tension s’il semble que du colorant s’échappe de la cellule ou remplisse d’autres cellules à proximité. S’il semble que le colorant s’échappe toujours de la cellule, retirez lentement l’électrode et trouvez une autre cellule. Il est important que le colorant ne fuie pas pour avoir un rapport signal/arrière-plan élevé dans l’image finale. - Attendez environ 15 minutes jusqu’à ce que les branches et les processus les plus fins apparaissent définis, coupez la tension et retirez doucement l’extrémité de l’électrode de la cellule.
- Imagez la cellule remplie.
REMARQUE : L’imagerie peut être effectuée immédiatement après le remplissage. Un objectif avec une ouverture numérique (NA) plus élevée permet d’obtenir une meilleure résolution. - Attendez que la cellule reprenne sa forme d’origine avant d’obtenir une image (15 à 20 min) avec un objectif 40x. Pour imager la cellule, ajustez le paramètre sur le confocal pour vous assurer que les branches et les processus les plus fins semblent définis.
- Configurez une pile z avec une taille de pas de 0,3 μm. Pendant l’imagerie, déplacez l’objectif jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de signal de la cellule et réglez-le en haut. Ensuite, déplacez l’objectif vers le bas (mise au point à travers la cellule) jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de signal, réglez-le en bas.