Intégration du cerveau de la drosophile dans une matrice pour l’imagerie en accéléré des neurones de l’horloge circadienne

Résumé

Source : Sabado, V., et al., Nagoshi, E. Imagerie en direct de fluorescence à résolution unicellulaire de Drosophile Horloges circadiennes dans la culture du cerveau larvaire. J. Vis. Exp. (2018).
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p style='line-height :1.2 ;margin-bottom :0pt ;margin-top :0pt ;' dir='ltr'>Cette vidéo montre la procédure d’intégration du Drosophila cerveau dans une matrice de fibrine, suivi d’une imagerie par fluorescence time-lapse des neurones de l’horloge circadienne pour analyser l’activité rythmique synchronisée avec les cycles lumière/obscurité.

Protocole

1. Intégration d’explants cérébraux dans une matrice 3D et montage (~20 min).
   1. Immerger un cerveau disséqué dans une solution de travail de fibrinogène (concentration finale de fibrinogène ~3,3 mg/mL, 10,5 μL par cerveau) comme suit :
   2. Aspirer 3,5 μL de milieu actif Schneider (SAM)/antibiotiques. Aspirez un cerveau disséqué de la dissection bien dans la même pointe de pipette sans distribuer le milieu SAM/antibiotiques dans la pointe.
   3. Distribuez le cerveau et le milieu sur le couvercle d’une boîte de Pétri stérile. Ajoutez encore 3,5 μL de SAM/antibiotiques et 3,5 μL de solution chaude de fibrinogène/SAM à 10 mg/mL à la goutte contenant le cerveau. Mélangez doucement la solution autour du cerveau en pipetant à l’aide d’une pointe de pipette de 20 μL.
      REMARQUE : L’utilisation d’une pipette plutôt que d’une pince dans cette étape évite de stresser le cerveau.
   4. Prélever 2 μL de la solution de travail du fibrinogène dans la goutte et l’appliquer en petit cercle sur la lamelle du plat à fond de verre. Ajouter 0,8 μL de thrombine et mélanger très rapidement à l’aide d’une pointe de pipette. Le fibrinogène est converti en fibrine et commence à polymériser.
   5. Prenez le cerveau qui se trouve dans la solution de travail du fibrinogène (step 1.1) entre une paire de pinces et positionnez-le sur la matrice une fois qu’une matrice blanche de fibrine est visible. Orientez le cerveau vers l’avant vers le bas (pour l’imagerie des neurones de l’horloge). Poussez-le aussi près que possible de la vitre de protection. Le caillot de fibrine est composé de couches de fibrine. Choisissez une couche et pliez-la sur le dessus du cerveau avec de petits mouvements doux sans détacher la matrice.
      1. Répétez l’opération 2 à 3 fois à partir de différentes parties du caillot pour stabiliser le cerveau.
         REMARQUE : Lorsque vous manipulez le cerveau avec une pince, veillez à ne pas le sécher ou à ne pas lui imposer de stress physique.
   6. Ajoutez 20 μL de SAM/antibiotiques sur le cerveau intégré pour arrêter l’action de la thrombine.
   7. Répétez la procédure pour monter les cerveaux restants. Jusqu’à cinq à six cerveaux peuvent être encastrés dans une parabole à fond de verre.
   8. Pour l’imagerie en direct à long terme, ajoutez 600 μL de SAM/antibiotiques dans le puits intérieur (la partie en verre). Placez une membrane prédécoupée en polytétrafluoroéthylène (PTFE) sur le dessus du fluide et collez-la à la graisse sous vide appliquée sur la partie en plastique du fond (Figure 1A).

Résultats

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5655	Je ne suis pas sûr qu’ils soient exactement les mêmes que ceux que nous avons en laboratoire. J’ai choisi « adapté à la culture de cellules d’insectes » chaque fois que disponible
CaCl2	Sigma-Aldrich	C7902	<
MgSO4.7H2O	Sigma-Aldrich	230391
NaCl	Sigma-Aldrich	S5886
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S5761
D-(+) Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
Yeast extract	Sigma-Aldrich	Y1000
Insulin	Sigma-Aldrich	I0516-5ML
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333
BIS-TRIS	Sigma-Aldrich	B4429
L-(−)-Acide malique	Sigma-Aldrich	M7397
D-(+)-Trehalose dihydrate	Sigma-Aldrich	T0167
Acide succinique	Sigma-Aldrich	S9512
acide fumarique	Sigma-Aldrich	F8509
α-acide cétoglutarique	Sigma-Aldrich	K1128
Non inactivé thermiquement, sérum de veau fœtal (FCS) mycoplasme et virus dépistés	BioConcept Ltd. Amimed	2-01F30-I style='background-color :#ffffff ;overflow :hidden ;padding :0px 3px ;vertical-align :bottom ;'>
HEPES-KOH, pH 7.4	E&K Scientific Products	EK-654011
KCl	Sigma-Aldrich	P5405
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S5011
Sucrose	Sigma-Aldrich	S7903
Fibrinogène de plasma bovin	Calbiochem (Merck)	341573-1GM	ATTENTION : Nocif par inhalation, par contact avec la peau et en cas d’ingestion. Manipuler sous flux laminaire
Thrombine de plasma bovin	Sigma-Aldrich	T9549	ATTENTION : Danger pour la santé, utilisez des gants
PDF, NH2-NSELINSLLLSLPKNMNDA-OH	Chi Scientific	custom made
Vaccum grease	Sigma-Aldrich	18405
35 mm Plat, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Diamètre du verre, non revêtu	MatTek	P35G-1.5-20-C
Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes	Fisherscientific	08-772A
Stérile 500 mL Steritop-GP 33 mm filtre fileté pour bouteille supérieure, 0.22 μm	Millipore	SCGPS05RE
Film de polytétrafluoroéthylène (PTFE)	Dupont	200A Teflon FEP Film
Millex-HV Unité de filtre de seringue, 0,45 μm, PVDF, 33 mm, stérilisé aux rayons gamma	Millipore	SLHV033RS
Millipore	SLGV033RS
Plat de dissection en verre à trois puits	Any company
Pince fine, taille 5, Dumont	Outils de science fine	11254-20
Scanner tandem inversé TCS SP5 microscope confocal, avec scanner résonant et détecteurs photomultiplicateurs HyD	Leica microsystem CMS GmbH
Chambre de contrôle de la température	Life Imaging Services	Le système de contrôle de température CUBE & BOX, conçu sur mesure
Contrôleur d’humidité de scène	Life Imaging Services	sur mesure
Water Immersion Micro Dispenser : distributeur, micro-pompe étendue série MP6 et logiciel Autoimmersion Objective Controller	Leica microsystem CMS GmbH
SUM-stack creation and 3D correction drift plugin	ImageJ software
10x deconvolution itérative	AutoQuant et Imaris software

tr style='hauteur :20px ;'>< style='couleur-de-fond :#ffffff ;couleur :#1a202c ;font-family :Roboto ;font-size :12pt ;font-weight :normal ;débordement :caché ;rembourrage :0px 3px ;vertical-align :bottom ;white-space :normal ;word-wrap :break-word ;wrap-strategy :4 ;'>Unité de filtre de seringue Millex-GV, 0,22 μm, PVDF, 33 mm, stérilisée aux rayons gamma