Visualisation de l’afflux de calcium dans les neurones du mésencéphale ventral dérivé d’embryons de souris

Résumé

Source : Bancroft, E. A., et al. Quantification de Ca²⁺ flux et leurs effets en aval dans les neurones primaires du mésencéphale de la souris. J. Vis. Exp. (2020)
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p style='line-height :1.2 ;margin-bottom :0pt ;margin-top :0pt ;' dir='ltr'>Cette vidéo démontre la visualisation en temps réel de l’afflux de calcium dans les neurones du mésencéphale ventral dérivé d’embryons de souris. À l’aide d’un vecteur viral pour exprimer un indicateur calcique, les neurones sont imagés au microscope confocal afin de suivre les changements d’intensité de fluorescence pendant l’activité calcique spontanée et induite par les neurotransmetteurs.

Protocole

1. Placage des cellules

REMARQUE : D’après l’expérience, environ 100 000 cellules viables par embryon sont collectées. Les souris enceintes de 2 à 3 mois ont généralement des portées de 8 à 10 embryons ; par conséquent, une estimation approximative du rendement total de cellules par souris enceinte chronométrée est d’environ 1 million de cellules.

1. À l’aide d’un hémocytomètre, effectuez une numération cellulaire puis diluez la suspension à 2 000 cellules/μL à l’aide d’un milieu de culture cellulaire. Triturer brièvement pour mélanger.
2. Retirez les lamelles avec une solution de laminine de l’incubateur et aspirez la solution de laminine restante des lamelles enrobées à l’aide d’un aspirateur. Plaquez rapidement pour éviter que les lamelles ne sèchent complètement. Pipeter 100 μL (2,0 x 10⁵ cellules/lamelle) sur chaque lamelle et placer des boîtes de Pétri dans un incubateur à 37 °C pendant 1 h.
3. Ajoutez délicatement 3 mL de milieu de culture cellulaire dans chaque plat et remettez-le dans l’incubateur à 37 °C. La préforme demi-moyenne change 2 fois par semaine pendant 2 semaines.

2. Infection de la culture cellulaire à 14 (jours in vitro) DIV avec des vecteurs

1. viraux adéno-associés (AAV)Pour chaque plat, préparez 1 mL de milieu DMEM sans sérum avec 1 μL de hSyn-GCaMP6f AAV (1.0 x 10¹³ titer)
2. Aspirez le milieu de culture cellulaire de chaque boîte et remplacez-le par 1 ml de milieu Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) exempt de sérum contenant hSyn-GCaMP6f. Remettez la parabole dans l’incubateur à 37 °C pendant 1 h.
3. Aspirez le milieu sans sérum contenant des AAV et remplacez-le par 3 mL de milieu de culture cellulaire. Remettez la vaisselle dans l’incubateur à 37 °C. Nous avons constaté que 5 à 7 jours d’infection par l’AAV permettent d’obtenir des niveaux idéaux d’expression de GCaMP. Continuez à changer de milieu tous les 2-3 jours pendant cette période d’infection virale.

3. Imagerie confocale Ca²⁺ en direct entre 19 et 21 jours in vitro (DIV)

REMARQUE : L’imagerie peut être effectuée entre 5 et 7 jours après l’infection virale. C’est la fenêtre idéale pour obtenir une expression visible du fluorophore à des niveaux qui permettent de détecter l’activité spontanée du Ca²⁺.

1. Préparation des tampons d’enregistrement
   1. Pour faire 1 L de tampon d’enregistrement HEPES, ajoutez : 9,009 g de NaCl, 0,3728 g de KCl, 0,901 g de D-glucose, 2,381 g d’acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazinéthanesulfonique (HEPES), 2 mL de solution mère 1 M CaCl₂ et 500 μL de solution mère 1 M MgCl₂ à 800 mL de H₂ distillé stérileO. Portez le pH à 7,4 avec du NaOH. Porter à un volume final de 1 L.
   2. Pour obtenir 200 mL de tampon d’enregistrement de glutamate de 20 μM, diluez 40 μL de solution mère de glutamate de 100 mM dans 200 mL de tampon d’enregistrement HEPES décrit ci-dessus.
2. Imagerie confocale
   1. Remplissez une boîte de Pétri stérile de 35 mm avec 3 mL de tampon d’enregistrement.
   2. Retirez une boîte de Pétri de 35 mm contenant des cultures infectées de l’incubateur à 37 °C. À l’aide d’une pince à pointe fine, saisissez soigneusement le bord d’une lamelle et transférez-la rapidement dans la boîte de Pétri remplie de tampon d’enregistrement. Remettez la lamelle restante dans le milieu dans l’incubateur à 37 °C. Transportez la parabole avec la mémoire tampon d’enregistrement jusqu’au microscope confocal.
   3. Démarrez le logiciel d’imagerie. Passez à l’étape suivante pendant l’initialisation.
   4. Démarrez la pompe péristaltique et placez la ligne dans le tampon d’enregistrement. Calibrer la vitesse d’écoulement à 2 mL/min.
   5. Transférez la lamelle infectée de la boîte de Pétri de 35 mm dans le bain d’enregistrement.
   6. À l’aide de l’objectif à immersion dans l’eau 10x et de la lumière en fond clair (BF), trouvez le plan de foyer et recherchez une région avec une forte densité de corps cellulaires neuronaux. Passez à l’objectif à immersion dans l’eau 40x et utilisez la lumière BF pour recentrer l’échantillon.
   7. Dans la fenêtre « Liste des colorants » de FluoView, sélectionnez AlexaFluor 488 et appliquez-le.
   8. Les expressions AAV peuvent être variables ; par conséquent, afin d’éviter la surexposition et le photoblanchiment des fluorophores, commencez par des réglages HV et de puissance laser faibles. Pour le canal AlexaFluor 488, réglez la haute tension (HV) sur 500, le gain sur 1x et le décalage sur 0. Pour la ligne laser 488, réglez la puissance sur 5 %. Pour augmenter le volume effectif imagé dans le plan z, augmentez la taille du sténopé à 300 μm. Utilisez l’option de balayage « focus x2 » pour ajuster de manière optimale les signaux d’émission aux niveaux de sous-saturation. À partir de là, les paramètres peuvent être ajustés jusqu’à ce qu’une visibilité idéale de chaque canal soit atteinte.
      REMARQUE : Pour capturer avec précision toute la gamme des flux Ca²⁺ avec GCaMP, ajustez les paramètres de base HV et de puissance laser pour permettre une augmentation de l’intensité fluorescente sans sursaturer le détecteur.
   9. Une fois les paramètres du microscope optimisés, déplacez la platine pour localiser une région avec plusieurs cellules affichant des changements spontanés de fluorescence GCaMP6f et concentrez-vous sur le plan souhaité pour l’imagerie.
   10. Utilisez l’outil « Clip rect » pour découper l’image d’imagerie à une taille qui peut atteindre un intervalle d’image d’un peu moins de 1 seconde. Ceci est nécessaire pour régler l’intervalle d’imagerie à 1 image par seconde.
   11. Règle la fenêtre « Interval » à une valeur de 1.0 et la fenêtre « Num » à 600.
       REMARQUE : Afin de fournir différents tampons d’enregistrement au point de temps souhaité (300 s), il est important de calibrer la latence de la pompe pour livrer la nouvelle solution au bain. Cela dépendra du débit de perfusion de la solution (2 mL/min) et de la longueur de la ligne utilisée pour pomper la solution.
   12. Pour capturer un film de la série T, sélectionnez l’option « Time », puis utilisez l’option de numérisation « XYt » pour commencer l’imagerie.
   13. Observez la barre de progression de l’imagerie et déplacez la ligne du tampon d’enregistrement HEPES dans le tampon d’enregistrement du glutamate de 20 μM au point de moment approprié (par exemple, si la latence de la pompe est calibrée pour délivrer la solution à 60 s, déplacez la ligne dans le tampon de glutamate à 240 images afin de délivrer du glutamate à 300 s).
   14. Une fois l’imagerie terminée, sélectionnez le bouton Série terminée et enregistrez le film de la série T terminé. Continuez à perfuser 20 μM de glutamate pendant 5 minutes supplémentaires, de sorte que les neurones cultivés aient été exposés au glutamate pendant un total de 10 minutes. Répétez ce processus pour chaque lamelle à imager.
   15. Après l’exposition supplémentaire de 5 minutes à 20 μM de glutamate, retirez la lamelle du bain et remettez-la dans la boîte de Pétri de 35 mm contenant le tampon d’enregistrement jusqu’à ce que la journée de l’imagerie soit terminée.

Matériaux