Imagerie des plaques bêta-amyloïdes dans des coupes de tissus cérébraux par immunomarquage et coloration à la curcumine

Résumé

Source : Maiti, P. et al.,. Etiquetage et imagerie des plaques amyloïdes dans le tissu cérébral à l’aide du polyphénol naturel curcumine. J. Vis. exp. (2019)

Cette vidéo démontre la procédure d’imagerie des plaques bêta-amyloïdes dans les coupes de tissu cérébral à l’aide de l’immunomarquage et de la coloration à la curcumine. L’immunomarquage fournit une spécificité pour la bêta-amyloïde, tandis que la curcumine se lie sélectivement aux fibrilles riches en feuilles de β, améliorant ainsi la visualisation. La co-localisation de la fluorescence rouge et verte confirme la présence de plaques.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le vétérinaire JoVE. <span style='font-family :Arial,sans-serif ;font-size :12pt ;font-style :normal ;font-variant :normal ;text-decoration :none ;vertical-align :baseline ;white-space :pre-wrap ;'>                                                                  

1. Perfusion des animaux

1. Préparez les tampons de fixateur et de perfusion.
   1. Préparez un tampon de phosphate de sodium de 0,1 M en ajoutant 80 g de chlorure de sodium (NaCl), 2 g de chlorure de potassium (KCl), 21,7 g d’hydrogénophosphate disodique (Na₂HPO₄·7H₂O), 2.59 g de dihydrogénophosphate de potassium (KH₂PO₄), et doublez l’eau distillée pour faire un total de 1 L.
   2. Préparez 4 % de paraformaldéhyde (PFA).
      1. Ajouter 40 g de paraformaldéhyde à 1 L de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (0,1 M, pH 7,4).
      2. Chauffer la solution de PFA à 60-65 °C et mélanger à l’aide d’un agitateur magnétique.
         REMARQUE : Le la température ne doit pas dépasser 65 °C.
      3. Ajoutez quelques gouttes d’hydroxyde de sodium (NaOH) (1 N) avec un compte-gouttes pour dissoudre complètement le PFA.
      4. Filtrer la solution PFA avec du papier filtre moyen à fin et conserver à 4 °C.
         REMARQUE : Le La solution est bonne pour un mois.
2. Effectuez une anesthésie et une perfusion animales.
   NOTE : B6SJL-Tg APP SwFlLon, PSEN1*M146L*L286V, 1136799Vas/J ( 5x family Alzheimer’s disease (5×FAD)) des souris témoins du même âge (n = 6 par groupe) ont été achetées auprès de vendeurs et élevées dans la animalerie de l’Université d’État de Saginaw Valley. Le génotypage a été confirmé par réaction en chaîne par polymérase (PCR). Human Alzheimer’s disease (AD) le tissu cérébral comprend le tissu cérébral AD post-mortem et le tissu témoin adapté à l’âge.
   1. Anesthésie l’animal avec un agent anesthésique approprié, tel que le pentobarbital sodique (390 mg/kg de poids corporel), ou un mélange de kétamine/xylazine (jusqu’à 80 mg/kg de poids corporel de kétamine et 10 mg/kg de poids corporel de xylazine) par injection intrapéritonéale (aiguille de 27 g et seringue de 1 ml). Vérifiez le niveau d’anesthésie en pinçant un orteil. Si l’animal ne répond pas, il est prêt pour la chirurgie de perfusion.
   2. Placez l’animal anesthésié en position couchée sur le plateau de chirurgie de perfusion et, à l’aide de petits ciseaux à iris, faites une incision à l’extrémité postérieure du ventricule gauche.
   3. Insérez une aiguille de perfusion 22-G dans le ventricule gauche et faites une petite incision au niveau de l’oreillette droite pour éliminer le liquide de perfusion du corps. Utilisez un système de perfusion alimenté par gravité pour permettre au liquide de perfusion glacé (0,1 M PBS, pH 7,4) de s’écouler pendant 5 à 6 minutes (débit de 20 à 25 ml/min).
      REMARQUE : A clair Le foie est l’indicateur d’une perfusion optimale.
   4. Remplacez la vanne tampon par une solution glacée de paraformaldéhyde à 4 % pour la fixation et laissez-la couler pendant 8 à 10 minutes.
      NOTE : Un tremblement suivi de membres durcis ou raides est un indicateur d’une bonne fixation.
   5. Retirez le cerveau du crâne à l’aide de ciseaux. À l’aide d’une spatule, prélevez le cerveau et placez-le dans un flacon de 4 % de PFA (au moins 10 fois le volume du cerveau) et conservez-le à 4 °C jusqu’à ce qu’il soit utilisé ultérieurement.

2. Tissue processing

1. Couper des sections de cryostat.
   1. Transfère le cerveau dans des solutions de saccharose graduées (10 %, 20 % et 30 %) et stocke à 4 °C pendant 24 h chacune, jusqu’à utilisation.
   2. À l’aide d’un cryostat à -22 °C, coupez des sections de 40 μm d’épaisseur. Prélever 10 à 20 sections par puits dans une plaque à 6 puits remplie de PBS et d’azoture de sodium (0,02 %).

3. Colocalize cur(curcumin) avec le Aβ anticorps dans les plaques Aβ et les oligomères.

1. Laver les sections du cryostat à partir de l’étape 2.1.2 avec PBS 3x dans une plaque à 12 puits.
2. Bloquez les sections avec 10 % de sérum de chèvre normal (NGS) dissous dans du PBS avec 0,5 % de Triton-X-100 à température ambiante pendant 1 h.
3. Jetez la solution de blocage. Incuber les sections avec des anticorps spécifiques de la bêta-amyloïde (Aβ) (6E10 ou A11, dilués 1:200) dissous dans une solution de blocage fraîche contenant 10 % de NGS et 0,5 % de Triton-X100 pendant une nuit à 4 °C dans un agitateur à 150 tr/min.
4. Jetez la solution d’anticorps et lavez les sections avec du PBS 3x pendant 10 minutes chacune.
5. Incuber avec l’étiquette d’anticorps secondaire avec fluorophore rouge (par exemple, Alexa
6. 594) pendant 1 h à température ambiante dans l’obscurité.
7. Laver avec du PBS 3x pendant 10 min chacun.
8. Laver avec 70 % d’alcool 1x.
9. Incuber les sections avec de la curcumine (Cur (10 μM)) pendant 5 min à température ambiante.
10. Laver avec de l’alcool à 70 % 3 fois pendant 1 min chacun.
11. Déshydrater avec de l’alcool à 90 % et à 100 % pendant 1 min chacun, effacer avec du xylène 2x pendant 5 min chacun, et monter sur les diapositives à l’aide de distyrene plasticizer xylene (DPX).
12. Visualisez à l’aide d’un microscope à fluorescence avec des filtres d’excitation/émission appropriés pour les signaux rouge et vert.

Matériaux