Visualisation de l’activité de la protéine kinase A chez une souris à l’aide de la microscopie d’imagerie à vie par fluorescence à deux photons

Abstract

Source : Jongbloets, B. C., et al. Visualisation de l’activité de la protéine kinase A chez des souris ayant un comportement fixe à l’aide de la microscopie d’imagerie à vie à vie à fluorescence à deux photons in vivo. (2019){{}}

Cette vidéo présente une procédure de microscopie d’imagerie à vie de fluorescence à deux photons pour visualiser l’activité de la protéine kinase A chez des souris ayant un comportement fixe pendant la locomotion forcée.

Protocol

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. In Vivo Microscopie d’imagerie à durée de vie par fluorescence à deux photons

1. Commence l’imagerie par microscopie à vie par fluorescence à deux photons (2pFLIM) à partir de 2 semaines après l’installation de la fenêtre crânienne. Minimiser l’interférence expérimentale due au stress en manipulant et en égratignant fréquemment la souris avant le début de l’étude d’imagerie afin d’habituer la souris.
2. Réglez la longueur d’onde du laser d’excitation à deux photons sur 960 nm à l’aide du logiciel qui contrôle le laser à deux photons.
3. Anesthésier la souris à l’aide de 4 % d’isoflurane. Confirmez l’anesthésie appropriée en pinçant la queue et en observant la fréquence respiratoire. C’est-à-dire qu’il ne devrait pas y avoir de réponse au pincement de la queue et que la fréquence respiratoire devrait être réduite à ~1 respiration par seconde. Pour minimiser le temps inutile de la procédure et parce que l’anesthésie ne dure que deux à trois minutes, les lubrifiants pour les yeux ne sont pas utilisés.
4. Transférez la souris anesthésiée sur le tapis roulant motorisé (Figure 1C) et montez la plaque de tête de la souris sur le support de plaque de tête de la configuration du tapis de course (voir Figure 1 pour plus de détails). Nettoyez la surface de la lamelle de la fenêtre crânienne de la souris avec de l’éthanol à 70 %.
5. Placez le tapis de course motorisé avec la souris montée sous l’objectif 2pFLIM. Appliquez une goutte d’eau distillée entre la lamelle de la fenêtre crânienne et l’objectif.
6. Laissez la souris montée se réveiller de l’anesthésie et s’acclimater à l’environnement du tapis roulant et du microscope pendant au moins 10 min. Surveillez le rythme respiratoire de la souris pendant que la souris montée se réveille de l’anesthésie.
7. Naviguez jusqu’au lieu d’injection sous épi-illumination. Documentez les caractéristiques repères (c’est-à-dire les vaisseaux sanguins) en fond clair pour faciliter l’imagerie de la même région d’intérêt (ROI) lors des sessions d’imagerie ultérieures.
8. Éliminez toute lumière entrante autre que la lumière émise par le tissu cérébral. Éteignez la source lumineuse épi-illumination et fermez le boîtier de la plate-forme 2pFLIM. Activez le PMT 2pFLIM en activant le contrôle de tension de commande matériel.
9. Acquérez une image 2pFLIM de la pile z à l’aide du logiciel d’acquisition 2pFLIM FLIMimage avec les paramètres recommandés suivants pour l’imagerie des somata tAKARα-positifs chez les souris éveillées. Réglez la moyenne d’image sur 3 images, la vitesse de balayage sur 2 ms/ligne, la taille de l’image sur 128 x 128 pixels et le champ de vision sur 90-100 μm. Ajustez les paramètres d’imagerie en fonction de la préparation et de la configuration matérielle.
10. Inspectez l’image acquise dans la vue FLIM (logiciel personnalisé développé en interne). Ajustez les paramètres d’imagerie en suivant l’étape 1.9 pour optimiser le nombre de photons et minimiser le photoblanchiment.

REMARQUE : Un nombre de photons intégré exploitable dans un ROI pour l’imagerie à vie d’un soma tAKARα-positif in vivo est de ~1 000−10 000 photons en fonction de l’amplitude du signal qui résulte d’un stimulus particulier.

1. Utilisez un champ de vision réduit, une vitesse de balayage réduite, une puissance laser accrue et un nombre accru d’images à calculer pour augmenter le nombre de photons intégrés et réduire l’erreur d’estimation de la durée de vie. Dans le même temps, assurez-vous d’utiliser la puissance laser minimale essentielle, la moyenne d’image et la vitesse de numérisation pour minimiser le photoblanchiment.
2. Imagez à un intervalle de temps régulier (par exemple, toutes les 30 à 60 s) en répétant l’acquisition de la pile z à l’aide des paramètres déterminés à l’étape 1.10. Acquérez des images de base 2pFLIM pendant au moins 15 minutes à une vitesse de tapis roulant nulle.
3. Réglez la vitesse de rotation du tapis roulant sur ~15 cm/s pendant 15 min tout en acquérant des images 2pFLIM. Continuez l’imagerie pendant ≥20 minutes après avoir arrêté la rotation du tapis roulant, afin d’évaluer la durée de l’activité PKA après l’arrêt de la locomotion forcée.
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p style='line-height :1.79999999999998 ;margin-bottom :0pt ;margin-top :0pt ;text-align :justify ;' dir='ltr'>2. Analyse de 2pFLIM Images

1. Ouvrez les images acquises dans FLIMview et définissez les paramètres suivants dans FLIMview.

1. Cliquez sur les champs de portée minimale et maximale du comptage de photons uniques (SPC) dans FLIMview. Entrez la valeur de plage SPC minimale et maximale appropriée, généralement comprise entre 1,2−2 et 10−12 ns, respectivement.

2. Cliquez sur le t₀ champ de valeur dans FLIMview et entrez le t₀ valeur (généralement ~2 ns). Cliquez sur le champ de la valeur seuil minimale de luminance à vie dans FLIMview et entrez la valeur seuil souhaitée à 5−30 photons.

2. Cliquez sur le bouton nouveau groupe (N) et attribuez un nom de groupe d’expériences. Cela générera un groupe qui combine les données de chaque image FLIM ajoutée.

3. Cliquez sur le ROI bouton dans le Roi Controls module de FLIMview et dessinez un ROI autour d’un soma tAKARα-positif. Réduisez la plage z-stack, en déplaçant la limite z inférieure et supérieure dans le z-stack Control curseurs dans FLIMview pour minimiser la contamination du signal provenant des photons d’arrière-plan à d’autres profondeurs z.

4. Cliquez sur le bouton + pour ajouter l’image FLIM au groupe (étape 2.2). Cliquez sur le Calc bouton pour calculer la durée de vie moyenne (LT, également appelée temps moyen d’émission de photons [MPET]), pour le ROI et l’erreur d’estimation de la durée de vie (δτ).

5. Ouvrez le fichier suivant de la série chronologique d’imagerie 2pFLIM. Répétez l’étape 2.4. Assurez-vous d’ajuster la position du ROI et de la plage z-stack pour mesurer le même soma tAKARα-positif au fil du temps, car il peut y avoir une dérive tissulaire au fil du temps.

6. Sélectionnez l’icône deltaMPET/MPET₀ dans le menu déroulant du Group Controls module. Cliquez sur le baseline# champ et entrez les index (par exemple, 1 2 3 4 5 pour les cinq premières images du groupe créé à l’étape 2.3). Cela définira la ou les images utilisées pour calculer la durée de vie de base (LT₀).

7. Cliquez sur Plot pour générer un graphique contenant la réponse FLIM (ΔLT/LT₀) de tAKARα pendant l’expérience dans les ROI définis. Modifications normalisées de la durée de vie (ΔLT) des ROI individuels par la durée de vie de base correspondante (LT₀) permettent de comparer l’activité de la PKA pendant la locomotion à travers différents ROI.

Results

Materials