Visualisation tridimensionnelle d’une infection par le virus de la rage dans le tissu cérébral d’une souris

Résumé

Source : Zaeck, L., et al. Imagerie 3D haute résolution de l’infection par le virus de la rage dans les tissus cérébraux éliminés par solvant. J. Vis. exp. (2019).

Cette vidéo montre le processus de préparation et d’imagerie des tissus cérébraux de souris infectés par le virus de la rage (RABV) pour évaluer la progression de l’infection. Il décrit les étapes clés, notamment la coloration des tissus avec des marqueurs fluorescents, la déshydratation, le nettoyage et le montage pour la microscopie confocale à balayage laser, aboutissant à la génération d’une représentation tridimensionnelle.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.

Du matériel cérébral archivé infecté par RABV et fixé au paraformaldéhyde (PFA) a été utilisé.

ATTENTION : Ce protocole utilise diverses substances toxiques et/ou nocives, y compris le PFA, le méthanol (MeOH), le peroxyde d’hydrogène (H₂O₂{TAG_33}}), l’azoture de sodium (NaN₃{TAG_39}}), tert-butanol (TBA), alcool benzylique (BA), benzoate de benzyle (BB) et éther diphénylique (DPE). Le MeOH et le TBA sont hautement inflammables. Évitez l’exposition en portant un équipement de protection individuelle approprié (une blouse de laboratoire, des gants et des lunettes de protection) et en effectuant des expériences dans une hotte. Collectez les déchets séparément dans des conteneurs appropriés et éliminez-les conformément aux réglementations locales. Le virus de la rage est classé comme un agent pathogène de niveau de biosécurité (BSL)-2 et peut donc généralement être manipulé dans des conditions BSL-2. Certaines activités, y compris les procédures qui peuvent générer des aérosols, travailler avec des concentrations élevées de virus ou travailler avec de nouveaux lyssavirus, peuvent nécessiter une classification BSL-3. La prophylaxie pré-exposition est recommandée pour le personnel à haut risque, y compris les gardiens d’animaux et les travailleurs de laboratoire. Reportez-vous aux réglementations des autorités locales.

1. Fixation du tissu cérébral et sectionnement

1. Fixer les échantillons de cerveau dans un volume approprié de 4 % de PFA dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS [pH 7,4]) pendant au moins 48 h à 4 °C (avec un rapport tissu/fixateur approximatif de 1:10 [v/v]).
2. Lavez les échantillons de tissus 3 fois dans du PBS pendant au moins 30 minutes à chaque lavage et stockez-les dans du NaN₃/PBS à 4 °C jusqu’à utilisation.
3. Sectionnez le tissu en sections de 1 mm d’épaisseur à l’aide d’un vibratome (vitesse d’avance de la lame : 0,3 à 0,5 mm/s, amplitude : 1 mm, épaisseur de la tranche : 1 000 μm).
4. Pour conserver la séquence de coupe correcte, stockez chaque section de tissu séparément dans un puits d’une plaque de culture cellulaire multipuits. Ajouter 0,02 % de NaN₃/PBS et stocker les coupes de tissu à 4 °C jusqu’à utilisation.

2. Prétraitement de l’échantillon au méthanol

REMARQUE : Effectuez toutes les étapes d’incubation avec une légère oscillation et, sauf indication contraire, à température ambiante. Protégez les échantillons de la lumière. Le prétraitement de l’échantillon a pour but global d’améliorer la diffusion des anticorps et de réduire l’autofluorescence tissulaire par l’exposition à MeOH et H₂O₂, respectivement.

1. Préparez des solutions de MeOH à 20 % (v/v), 40 %, 60 % et 80 % dans de l’eau distillée. Par exemple, pour 20 % de MeOH, ajoutez 10 ml de MeOH 100 % à 40 ml d’eau distillée dans un récipient refermable approprié et mélangez en le retournant.
2. Transvaser les échantillons dans des récipients de taille raisonnable (p. ex. tubes à réaction de 5 ml). Veillez à utiliser des matériaux chimiquement résistants aux réactifs utilisés dans ce protocole. Par exemple, notez que si le polypropylène convient, le polystyrène ne l’est pas.
   REMARQUE : Les spécifications de volume dans ce protocole font référence à des tubes à réaction de 5 ml. Si un autre récipient est utilisé, ajustez les volumes en conséquence.
3. Incuber les échantillons dans 4 mL de chaque concentration de la série préparée de solutions de MeOH dans l’ordre croissant pendant 1 h chacun.
4. Incuber les échantillons 2 fois pendant 1 h chacun dans du MeOH pur (100 %).
5. Refroidir les échantillons à 4 °C (p. ex., dans un réfrigérateur allant au laboratoire).
6. Préparez une solution de blanchiment (5 % H₂O{{TAG_175 TAG_176}}2 en diluant, par exemple, une solution mère à 30 % de H₂O₂{TAG_191}}{}}} à 1:6 MeOH pur (100 %) et le refroidir à 4 °C.
7. Retirez le MeOH à 100 % des échantillons réfrigérés et ajoutez 4 mL de solution de blanchiment pré-réfrigérée (5 % H₂O₂ dans MeOH). Incuber toute la nuit à 4 °C.
8. Remplacez la solution de blanchiment par 4 ml de MeOH à 80 % et incubez pendant 1 h. Continuer à utiliser la série préparée de solutions de MeOH par ordre décroissant pendant 1 h chacune jusqu’à ce que les échantillons aient été incubés pendant 1 h dans 4 mL de MeOH à 20 %.
9. Lavez les échantillons 1 fois pendant 1 h avec 4 ml de PBS.

3. Immunomarquage

REMARQUE : Effectuez toutes les étapes d’incubation avec une légère oscillation et, sauf indication contraire, à température ambiante. Protégez les échantillons de la lumière. Pour prévenir la croissance microbienne, ajoutez NaN₃ à une concentration finale de 0,02 % aux solutions de cette section. Les échantillons de tissus sont encore plus perméabilisés par un traitement avec des détergents non ioniques Triton X-100 et Tween 20. Le sérum normal est utilisé pour bloquer la liaison des anticorps non spécifiques. De la glycine et de l’héparine sont ajoutées pour réduire le bruit de fond de l’immunomarquage.

1. Lavez les échantillons 2 fois pendant 1 h chacun dans 4 mL de Triton X-100/PBS à 0,2 %.
2. Perméabiliser les échantillons pendant 2 jours à 37 °C avec 4 mL de triton X-100 à 0,2 %/sulfoxyde de diméthyle à 20 % (DMSO)/0,3 M de glycine/PBS.
3. Bloquer la liaison non spécifique des anticorps en incubant les échantillons pendant 2 jours à 37 °C dans 4 mL de Triton X-100 à 0,2 %, de DMSO à 10 % et de sérum normal à 6 %, de PBS et de sérum.
   REMARQUE : Utilisez du sérum normal de la même espèce que celle dans laquelle l’anticorps secondaire a été élevé pour obtenir des résultats de blocage idéaux.
4. Incuber les échantillons dans 2 mL de solution d’anticorps primaires (sérum normal à 3 %/DMSO/PTwH à 5 % [PBS-Tween 20 avec héparine] + anticorps/anticorps primaires) pendant 5 jours à 37 °C. Rafraîchir la solution d’anticorps primaires après 2,5 jours.
   1. Pour le PTwH, reconstituer le sel d’héparine sodique dans de l’eau distillée pour obtenir une solution mère de 10 mg/mL (conserver cette solution, aliquote, à 4 °C). Ajouter la solution mère à 0,2 % de Tween 20/PBS jusqu’à une concentration finale de 10 μg/mL.
      REMARQUE : Le choix de la dilution correcte des anticorps peut nécessiter une optimisation. En général, les concentrations standard d’immunohistochimie sont un bon point de départ.
5. Lavez les échantillons pendant 1 jour dans 4 ml de PTwH, en remplaçant le tampon de lavage au moins 4 à 5 fois pendant la journée et en laissant le lavage final pendant la nuit.
6. Incuber les échantillons dans 2 mL de solution d’anticorps secondaires (sérum normal à 3 %/PTwH + anticorps/anticorps secondaires) pendant 5 jours à 37 °C. Rafraîchir la solution d’anticorps secondaires après 2,5 jours.
   1. Diluer l’anticorps secondaire à 1:500 dans une solution d’anticorps secondaires (c.-à-d. 4 μL dans 2 mL).
7. Lavez les échantillons pendant 1 jour comme décrit à l’étape 3.5, en laissant le lavage final pendant la nuit.

4. Coloration nucléaire

REMARQUE : Effectuez toutes les étapes d’incubation avec une légère oscillation et, sauf indication contraire, à température ambiante. Protégez les échantillons de la lumière. Si aucune coloration nucléaire n’est requise ou si la longueur d’onde/le spectre d’émission d’excitation du rouge de thiazole (TO-PRO-3) est nécessaire pour l’excitation ou la détection d’un autre fluorophore, sautez cette étape.

1. Diluez le colorant d’acide nucléique TO-PRO-3 à 1:1 000 dans PTwH et incubez les échantillons dans 4 mL de solution de coloration nucléaire pendant 5 h.
2. Laver les échantillons pendant 1 jour comme décrit à l’étape 3.5, en laissant le lavage final pendant la nuit.
   REMARQUE : Après les lavages, les échantillons peuvent être stockés dans du PBS à 4 °C jusqu’à l’effacement optique.

5. Nettoyage des tissus

REMARQUE : Effectuez toutes les étapes d’incubation avec une légère oscillation et, sauf indication contraire, à température ambiante. Protégez les échantillons de la lumière. Les échantillons de tissus sont déshydratés dans une série graduée de solutions d’ATB. Comme l’immunocoloration nécessite des solutions aqueuses, toutes les procédures de coloration doivent être terminées avant l’élimination des tissus. La clairance optique et l’adaptation de l’indice de réfraction sont obtenues par un traitement avec un mélange de BA, BB et DPE. La solution nettoyante est complétée par du DL-α-tocophérol en tant qu’antioxydant.

1. Préparer des solutions d’ATB à 30 % (v/v), 50 %, 70 %, 80 %, 90 % et 96 % dans de l’eau distillée. Par exemple, pour 30 % d’ATB, ajoutez 15 ml d’ATB à 100 % à 35 ml d’eau distillée dans un récipient refermable approprié et mélangez en l’inversant.
   REMARQUE : L’ATB a un point de fusion de 25 à 26 °C ; Ainsi, il a tendance à être solide à température ambiante. Pour préparer des solutions d’ATB, chauffez la bouteille bien scellée à 37 °C dans un incubateur ou un bain-marie.
2. Déshydrater les échantillons avec 4 mL de chaque concentration de la série préparée de solutions d’ATB par ordre croissant pendant 2 h chacune. Laissez le TBA à 96 % pendant la nuit.
3. Déshydrater davantage les échantillons dans de l’ATB pur (100 %) pendant 2 h.
4. Préparer la solution de clarification BABB-D15.
   REMARQUE : BABB-D15 est une combinaison de BA et BB (BABB) qui est mélangée avec DPE à un rapport de x :1, où x est spécifié dans le nom de la solution, Dans ce cas, 15.
   1. Pour BABB, mélangez une partie de BA avec deux parties de BB.
   2. Mélangez BABB et DPE dans un rapport de 15:1.
   3. Ajouter 0,4 % en volume de DL-α-tocophérol (vitamine E).
      REMARQUE : Par exemple, pour 20 ml de BABB-D15, mélangez 6,25 ml d’AB avec 12,5 ml de BB. Ajoutez 1,25 ml de DPE et complétez-le avec 0,08 ml de DL-α-tocophérol.
5. Nettoyer les échantillons dans une solution éclaircissante jusqu’à ce qu’ils soient optiquement transparents (2 à 6 h).
6. Les échantillons peuvent être stockés à 4 °C dans le BABB-D15, à l’abri de la lumière, jusqu’au montage et à l’imagerie.

6. Montage d’échantillons

1. À l’aide d’une imprimante 3D, imprimez la chambre d’imagerie et le couvercle (matériau : copolyester [CPE], buse : 0,25 mm, hauteur de couche : 0,06 mm, épaisseur de paroi : 0,88 mm, nombre de parois : 4, remplissage : 100 %, pas de structure de support).
2. Assemblez la chambre d’imagerie (Figure 1).
   1. Montez une lamelle ronde (diamètre : 30 mm) sur la chambre d’imagerie avec du caoutchouc de silicone RTV-1 (vulcanisation à température ambiante monocomposante). Retirez l’excès de caoutchouc de silicone à l’aide d’un coton-tige imbibé d’eau et durcissez pendant la nuit.
   2. Montez une lamelle ronde (diamètre : 22 mm) sur le couvercle avec du caoutchouc de silicone RTV-1. Retirez l’excès de caoutchouc de silicone à l’aide d’un coton-tige imbibé d’eau et durcissez pendant la nuit.
3. Placez l’échantillon dans une chambre d’imagerie, ajoutez un petit volume de BABB-D15 et insérez le couvercle. Remplissez la chambre avec BABB-D15 par l’entrée, à l’aide d’une aiguille hypodermique (27 G x 3/4 pouce [0,40 mm x 20 mm]).
4. Branchez l’entrée et scellez la chambre d’imagerie avec du caoutchouc de silicone RTV-1. Durcir toute la nuit dans l’obscurité.

7. Imagerie et traitement d’image

1. Configurez l’acquisition d’images en sélectionnant les lignes laser respectives pour correspondre aux fluorophores utilisés. Ajustez les plages de détection de chaque détecteur pour éviter le chevauchement du signal entre les canaux.
   REMARQUE : Les plages de détection exemplaires pour Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 568 et TO-PRO-3 sont respectivement de 500 à 550 nm, de 590 à 620 nm et de 645 à 700 nm.
2. Choisissez les paramètres d’acquisition, définissez les bords supérieur et inférieur de la pile z et acquérez la pile d’images.
   REMARQUE : Les paramètres d’acquisition exemplaires sont un balayage séquentiel avec une taille de pixel de 60 à 90 nm, une taille de pas z de 0,5 μm, une moyenne de ligne de 1, une vitesse de balayage de 400 Hz et une taille de sténopé de 1 unité Airy.
3. Traitez la pile d’images à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images approprié (par exemple, Fidji) pour générer des projections 3D ou effectuer des analyses approfondies.
   REMARQUE : En raison de la grande taille des fichiers image acquis, l’utilisation d’un poste de travail est généralement nécessaire.
   1. Ouvrir le(s) fichier(s) d’acquisition ou d’image aux Fidji (Fichier |{ {TAG_589}} Ouvrir | Sélectionnez les fichiers).
      1. Si vous utilisez, par exemple, des fichiers LIF, sélectionnez ou désélectionnez les options souhaitées dans la boîte de dialogue Bio-Formats. Afficher la pile avec Hyperstack. En dehors de cela, aucune sélection ou coche spécifique n’est nécessaire. Appuyez sur OK.
      2. Si le fichier contient plusieurs piles d’images, sélectionnez celles à analyser et confirmez en appuyant sur OK.
   2. Effectuez une correction de blanchiment en divisant l’image fusionnée en canaux individuels (Image |{ {TAG_645}} Couleur | Outil de canaux, puis sélectionnez Plus | Diviser les chaînes). Pour chaque canal, sélectionnez Correction de blanchiment (Image {TAG_674}}| Ajuster | Correction de l’eau de Javel) et choisissez Rapport simple{TAG_692}} (intensité de fond : 0.0).
      REMARQUE : Dans certains cas, par exemple, lorsqu’il n’y a pas de décroissance linéaire du signal ou que le signal est trop faible dans l’ensemble, Le rapport simple peut échouer. Vous pouvez également essayer Ajustement exponentiel ou sauter la correction de javellisant.
   3. Ajustez la luminosité et le contraste de chaque canal à l’aide des curseurs (Image |{ {TAG_724}} Ajuster | Luminosité | {TAG_738}}}{{}}}TAG_739).
   4. Fusionner les canaux (Image |{ {TAG_754}} Couleur | Fusionner les canaux), faire un composite (Image | {TAG_772}}{TAG_774}}Couleur {TAG_776{TAG_777}}| {}}| {TAG_778}}{TAG_779}}{}}Outil de canaux, puis sélectionnez Plus | Créer un composite), et convertissez-le au format RVB (Image | {TAG_804}}Couleur | Chaînes Outil, puis sélectionnez {TAG_816}}Plus {TAG_819}}| {}}Convertir en RGB{TAG_825}}).
   5. Si nécessaire, redimensionnez la pile d’images pour réduire le temps de calcul et la taille du fichier (Image | Ajuster | {TAG_845}}Taille, les deux options cochées plus l’interpolation bilinéaire).
   6. Générer une projection 3D (Image | {TAG_863}}Piles | Projet 3D{TAG_873}}). Choisissez Point le plus brillant comme méthode de projection et définissez l’espacement des tranches pour qu’il corresponde à la taille du pas z de la pile d’images acquise. Pour une qualité maximale, réglez l’incrément de l’angle de rotation sur 1 et activez l’interpolation. Modifiez la rotation totale, les seuils de transparence et l’opacité selon vos besoins.
   7. Si nécessaire, réajustez le contraste et la luminosité en reconvertissant la projection 3D au format 8 bits (Image | Type | 8 bits{TAG_908}}). Utilisez les curseurs respectifs (Image | Ajuster | Luminosité | }Contraste) et reconvertir la pile d’images au format RVB comme décrit à l’étape 7.3.4.
   8. Enregistrez la projection 3D sous le nom . Fichier TIF (format de fichier image) et fichier .AVI (format de fichier vidéo).

Résultats

Matériaux