Utilisation de la réflectométrie spectrale pour déterminer les diamètres axonaux myélinisés dans une tranche de cerveau de souris fixe

Résumé

Source : Kwon, J., et al., Microscopie réflectométrique spectrale sur axones myélinisés in situ. J. Vis. Exp. (2018)

Cette vidéo montre l’utilisation de la réflectométrie spectrale avec un microscope confocal hyperspectral pour analyser les modèles d’interférence et déterminer les diamètres axonaux myélinisés dans des tranches de tissu cérébral fixe.

Protocole

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p style='line-height :1.7999999999999999 ;margin-bottom :0pt ;margin-top :12pt ;' dir='ltr'>Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par l’examen éthique animal approprié comité.

1. Calibration

1. Allumez le microscope au moins 1 h avant l’imagerie pour permettre la stabilisation thermique de la source laser (voir Tableau des matériaux). Ensuite, allumez le logiciel pour le balayage spectral (voir Table des matériaux) et cliquez sur le bouton Acquérir en haut de l’interface utilisateur graphique (Figure 1a).
2. Allumez l’obturateur logiciel pour le laser à lumière blanche (WLL) et le tube photomultiplicateur (PMT) (Figure 1a).
3. Sélectionnez le mode xyΛ dans la liste déroulante en mode d’acquisition, puis le mode d’entrée laser passe automatiquement de Pourcentage constant à Puissance constante. Décochez la case Mouvement automatique du SP. Ensuite, réglez la fenêtre spectrale du laser d’entrée sur 470–670 nm et la taille du pas spectral sur 4 nm sur les paramètres de balayage Lambda à excitation λ (Figure 1b).
4. RÉGLEZ la plage spectrale de PMT sur 450-690nm en double-cliquant ou en déplaçant la barre de réglage pour la plage spectrale (Figure 1c).
   Remarque : Cette plage spectrale doit inclure la bande passante complète de la source d’entrée.
5. Sélectionnez un objectif à immersion dans l’eau, avec une ouverture numérique élevée (NA > 0,7) et donnez n’importe quelle valeur au PMT et à la puissance laser pour activer AOBS (Séparateur de faisceau acousto-optique) configuration et bouton Live Scan. Changez le chemin optique en vérifiant la réflexion dans la configuration AOBS (Figure 1d).
6. Montez un miroir de référence (voir Tableau des matériaux) sur la platine du microscope. La surface du miroir doit être tournée vers la lentille de l’objectif. S’il n’est pas facile de monter le miroir sur la platine du microscope, collez un miroir sur une plaque plate (e.g., slide verre).
7. Contrôlez la platine du microscope pour aligner le plan focal sur la surface du miroir.
8. Ajustez le gain PMT et la puissance laser, en tenant compte de la plage dynamique du détecteur, puis changez le mode d’entrée laser de Pourcentage constant à Puissance constante.
   Note : Comme c’est généralement le cas, un gain PMT de 500 (V) et une puissance laser relative de 0,1 % sont utilisés à 570 nm.
9. Confirmez en mode pseudo-couleur pour vérifier qu’il n’y a pas de saturation sur toute la plage de longueurs d’onde. Si une saturation est observée, réduisez la puissance du laser (Figure 1a).
10. Exécutez l’acquisition Lambda Scan.
11. Retirez le miroir de la scène et répétez la même acquisition sans échantillon afin d’obtenir la référence sombre (i.e., décalage sombre).
12. Enregistrez les données dans un format TIF multi-empilés.

2. SpeRe (Réflectométrie spectrale) Acquisition d’images

1. Place le tissu monté sur la platine du microscope. Pour aligner grossièrement le tissu sur le plan focal de l’objectif, utilisez le mode de fluorescence à grand champ à travers un oculaire.
2. Avec le Live Scan de marche, contrôlez la platine du microscope pour aligner le plan focal sur la région d’intérêt dans le tissu. Pour éviter le bruit de fond de la lamelle, sélectionnez la région cible d’au moins 15 μm de profondeur à partir de l’interface verre-tissu.
3. Acquérez la pile d’images spectrales pour la région cible en suivant la même procédure que celle décrite aux étapes 1.1 à 1.10.
4. Enregistrez les données pour le tissu et le décalage foncé dans un Multistacked TIF format.
   Remarque : Le L’expérimentateur peut faire une pause à ce stade.

3. Traitement et analyse d’images

1. Ouvrez les données spectrales (TIF multi-empilées) pour le miroir de référence et le tissu cérébral dans ImageJ.
2. Sélectionnez les zones d’intérêt (ROI) pour les piles d’images ouvertes : la zone centrale pour le miroir de référence et le segment d’une fibre axonale pour le tissu cérébral.
3. Acquérez les spectres bruts pour les ROI sélectionnés en exécutant Image → Stacks → Plot Z-axis profile dans le menu ImageJ.
4. Ouvrez les données de décalage sombre, l’une prise pour le miroir de référence et l’autre prise pour le tissu cérébral.
5. Acquérez les spectres pour les décalages sombres en exécutant Image → Stacks → Plot Z-axis profile dans le menu ImageJ.
6. Enregistrez tous les spectres acquis en utilisant le Copy and Paste options.
   Note : Pour l’imagerie SpeRe, il est recommandé d’utiliser le champ d’imagerie central pour minimiser les aberrations optiques hors axe. Les fibres axonales peuvent être structurellement hétérogènes sur toute leur longueur. Par conséquent, il est recommandé de sélectionner le ROI sur un petit segment axonal, généralement < 5 μm, afin de minimiser l’artefact de volume partiel.

Résultats

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Objectif apochromatique 40×, NA 1.1	Leica Microsystems	15506357	.
Fluoromyéline, verte	Thermo Fisher	F34651	,
Leica SP8 TCS, microscope	Leica Microsystems	SP8
Logiciel d’imagerie	Leica Microsystems	LAS-X
Matlab	MathWorks
{Miroir	Thorlabs	PF10-03-P01	Recouvert d’argent protégé.
Capuchon de protection	Thermo Fisher	3306	Épaisseur : #1 (0,13 à 0,17 mm).
Verre lamel	Muto Pure Chemicals	5116-20F	Épaisseur : ~1 mm.
Super colle	Henkel	Loctite 406	Utilisez un équipement de distribution pour éviter tout contact avec la peau ou les yeux.
Laser à lumière blanche	Photonique NKT	EXB-6	EXB-6 a été abandonné et remplacé par EXU-6.

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