Visualisation des projections des motoneurones et de la ramification des axones à l’aide de la microscopie à fluorescence à feuillet de lumière

Résumé

Source : < style='text-decoration :none ;' href='https ://app.jove.com/v/57546/visualization-of-motor-axon-navigation-and-quantification-of-axon-arborization-in-mouse-embryos-using-light-sheet-fluorescence-microscopy'>Liau, E. S. et al. Visualisation de la navigation axonale motrice et quantification de l’arborisation axonale chez les embryons de souris à l’aide de la microscopie à fluorescence à feuille de lumière. J. Vis. Exp. (2018).
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p style='line-height :1.2 ;margin-bottom :0pt ;margin-top :0pt ;text-align :justify ;' dir='ltr'>Cette vidéo démontre l’utilisation de la microscopie à fluorescence à feuille de lumière pour imager les projections de motoneurones et la ramification axonale dans embryons de souris transgéniques. Il décrit les étapes de la préparation des échantillons, de l’imagerie et de la reconstruction 3D de la ramification axonale pour évaluer la croissance et la connectivité des motoneurones.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par l’éthique animale appropriée comité d’examen.

1. Microscopie à fluorescence à feuillet de lumière (LSFM) (2–3 h)

1. Sample set-up
   1. Configure des optiques d’éclairage 5X/0.1 et des optiques de détection 5X/0.16. Assemblez le porte-échantillon et le capillaire de l’échantillon (1,5 mm de diamètre intérieur, vert) et placez-les dans le microscope.
      NOTE : Reportez-vous au manuel d’utilisation du microscope pour les procédures de configuration détaillées.
   2. Montez l’embryon comme suit :
      1. Préparez la pointe de pipette P200 en coupant la partie supérieure de manière à ce qu’elle s’adapte au diamètre du capillaire et retirez la partie pointue (~ 3 mm) pour la fixation de l’échantillon.
      2. Faites fondre l’extrémité émoussée de la pointe de la pipette à l’aide d’une petite flamme.
      3. Éteignez la flamme et fixez rapidement l’embryon verticalement sur l’extrémité fondue.
      4. Ajustez la partie supérieure de la pointe de la pipette avec le capillaire de l’échantillon.
   3. Laissez le tampon de la chambre s’équilibrer avec l’embryon pendant 1 minute pour éliminer les débris ou les bulles.
   4. À l’aide du logiciel d’imagerie, sélectionnez Locate capillary sous le Locate tab et ajustez les axes x, y et z pour positionner le capillaire de l’échantillon.
   5. Sélectionnez Locate sample et zoomez à 0,6X pour vous concentrer sur l’embryon. Faites pivoter l’embryon pour vous assurer que l’axe long du membre imagé s’aligne avec le trajet de la lumière des deux sources lumineuses (Figure 1B).
2. Acquisition d’image
   1. Under the Acquisition tab, définit les paramètres du chemin de lumière tels que les objectifs de détection, le filtre de blocage laser, le séparateur de faisceau, les caméras et les lasers.
      NOTE : Le canal de la protéine fluorescente verte (GFP) est utilisé dans cette expérience (longueur d’onde d’excitation : 488 nm ; filtre d’émission : passe-bande (BP) 505 à 545 nm ; séparateur de faisceau : SPS LP 560).
   2. Cochez la case du balayage pivot pour la réduction des ombres.
   3. Définissez les paramètres d’acquisition : profondeur de bits, 16 bits ; zoom, 0,36-0,7X ; Éclairage simple face (gauche/droite) ou éclairage double face.
   4. Click Continuous et réglez l’intensité du laser, le temps d’exposition, la puissance du laser et la position de la feuille de lumière pour acquérir des images plus nettes.
      NOTE : La puissance du laser est maintenue aussi faible que possible pour minimiser les dommages causés par les photos.
   5. Appuyez sur STOP pour terminer l’acquisition de l’image.
3. Acquisition multidimensionnelle
   1. Définissez la z-stack en déplaçant la position Z pour la première et la dernière image. Cliquez sur Optimal pour définir le numéro de tranche.
   2. Cliquez sur Start Experiment pour acquérir la pile z sélectionnée.
   3. Lorsque c’est fait, enregistrez l’image au format .czi.
4. Traitement d’image (facultatif)
   1. Proceed with Fusion des deux côtés sous le Lightsheet Processing canal si l’éclairage double face est appliqué. Multiview processing est nécessaire si plusieurs vues sont acquises pour combiner des images sous plusieurs angles.
   2. Créez une image 2D en utilisant les données des pixels de plus haute intensité le long de l’axe de projection sous le Maximum Intensity Projection chaîne.
   3. Sous le Copy channel, cliquez sur Subset pour sélectionner des sous-ensembles d’images de l’ensemble original.

2. quantification de l’arborisation axonale (30 min pour chaque nerf individuel)

1. Ouvrez le fichier image dans le logiciel d’analyse d’image (par défaut, l’image contenant les données XYZ est ouverte en mode Surpass et en vue 3D).
2. Ajustez la couleur, la luminosité et le contraste de l’image à l’aide de la Display Adjustmentwindow (Modifier | show display display adjustment) pour détecter les filaments en fonction du contraste d’intensité locale.
3. Cliquez sur le Add New Filaments icône et sélectionnez l’icône Autopath (no loop) algorithme dans le menu déroulant.
4. Sélectionnez la région d’intérêt (dans ce cas, l’axone de segmentation d’intérêt). Cliquez sur Next lorsque vous avez terminé.
5. Définissez les points de départ et d’amorçage en attribuant les mesures de diamètre les plus grandes et les plus fines, qui peuvent être mesurées à l’aide de la Slice .
6. Attribuez un point de départ à la limite de la région d’intérêt. Pour réaliser l’ajout ou la suppression manuelle de points de départ, changez d’abord le mode du pointeur (Naviguer | Sélectionner) puis Maj + clic droit aux points d’intérêt.
7. Sélectionnez des seuils manuels pour les points de départ afin de vous assurer que toute l’arborisation visible est marquée. Changer le mode du pointeur (Naviguer | Sélectionner) puis Maj + clic gauche aux points d’intérêt pour ajouter ou supprimer manuellement des points de départ.
   NOTE : Il est important de supprimer manuellement les bruits de fond et les signaux des nerfs voisins.
8. Cochez la case Supprimer les points de départ autour des points de départ.
9. Check Supprimer les segments déconnectés permettre d’exclure les points trop éloignés, et qui peuvent représenter un bruit de fond. Indiquez le Maximum Gap Length <span style='font-family :Arial,sans-serif ;font-size :12pt ;font-style :normal ;font-variant :normal ;font-weight :400 ;text-decoration :none ;vertical-align :baseline ;white-space :pre-wrap ;'>à l’étape suivante pour définir la limite supérieure de exclusion.
10. Ajustez le seuil de soustraction de l’arrière-plan, qui utilise un filtre gaussien pour estimer l’intensité de l’arrière-plan de chaque voxel.
11. Définissez le seuil automatique pour le diamètre de la dendrite à l’aide de la Zone de section approximative algorithme.
12. Sautez les étapes de calcul de la colonne vertébrale.
13. Terminez le processus et choisissez le style et la couleur souhaités.
14. Décochez la case de volume dans Properties pour afficher uniquement les axones reconstruits.
15. Sous le Statistics tab, select Detailed. Utilisez Filament No. Dendrite Terminal Points pour quantifier les terminaisons nerveuses motrices en tant qu’indicateur de l’arborisation de l’axone moteur.
    NOTE : Statistique Une annotation peut être ajoutée si vous le souhaitez.
16. Exporter l’image de l’axone reconstruit sous forme de fichier .tif.

Résultats

Matériaux