Analyse des cellules immunitaires dans les tissus nerveux de souris à l’aide de la cytométrie en flux

Résumé

Source : Hidmark, A. S., et al. Analyse des cellules immunitaires dans les nerfs sciatiques simples et le ganglion de la racine dorsale d’une seule souris à l’aide de la cytométrie en flux. J. Vis. exp.{{TAG_ 27}} (2017).

Cette vidéo montre l’utilisation de la cytométrie en flux pour analyser les cellules immunitaires dans les nerfs sciatiques et les ganglions de la racine dorsale de souris. Le processus consiste à marquer les cellules immunitaires avec des anticorps marqués aux fluorophores et à la biotine, à stabiliser et à perméabiliser les cellules et à utiliser des marqueurs fluorescents pour détecter les caractéristiques de surface cellulaire et nucléaires. La technique permet une évaluation quantitative de l’hétérogénéité des cellules immunitaires dans les tissus nerveux.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.

1. digestion du nerf sciatique et DRG

1. Préparez le milieu de digestion (milieu Eagle modifié de Dulbecco [DMEM], 10 mM d’acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazineéthanesulfonique [HEPES], 5 mg/mL d’albumine sérique bovine [BSA], 1,6 mg/mL de collagénase de type 4) complété par 100 μg/mL de désoxyribonucléase, et conservez-le sur de la glace.
   NOTE : La quantité de milieu de digestion nécessaire par souris (nerfs sciatiques + DRG) est de 1 ml. Une fois préparées, les aliquotes du milieu de digestion peuvent être stockées à -20 °C.
2. Transférez les nerfs sciatiques et les DRG d’une souris dans des tubes séparés de 1,5 ml contenant 500 μL de milieu de digestion. Pour les nerfs sciatiques, coupez le matériau en 15 à 20 morceaux à l’aide de ciseaux à ressort, puis incubez les suspensions de tissus dans un incubateur à agitation à 37 °C pendant 20 min en agitant doucement (≤ 450 tr/min).
3. Triturez à plusieurs reprises la suspension cellulaire à travers la pointe de la pipette de 1 000 μL pour dissocier mécaniquement tout tissu incomplètement digéré.
   NOTE : Si la suspension est difficile à titrer, coupez la pointe de la pipette avec des ciseaux pour créer une extrémité émoussée. Incuber la suspension tissulaire à 37 °C pendant 20 min en l’agitant doucement (≤ 450 tr/min).
4. Répétez la trituration à l’aide d’une pointe de pipette de 1 000 μL et incubez pendant 10 minutes supplémentaires à 37 °C en agitant doucement (≤ 450 tr/min).
5. Préparez le tampon FACS (solution saline tamponnée au phosphate [PBS] complétée par 10 % de sérum de veau fœtal [FCS] et 1 mM d’acide éthylènediamine tétraacétique [EDTA]) et stockez-le sur de la glace. Rincez et trempez un tamis en acier inoxydable d’une maille de 140 μm avec un tampon de tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) dans une boîte de Pétri de 60 x 15 mm sur de la glace.
   NOTE : Les filtres à tamis en nylon sont à éviter car ils entraînent une perte significative du rendement des cellules nucléées.
6. Passez à plusieurs reprises les suspensions de tissus à travers le filtre à tamis de 140 μm, alors qu’il est maintenu au-dessus de la boîte de Pétri, avec une pince émoussée, sur de la glace. Prélevez la suspension cellulaire de la boîte de Pétri et transférez-la dans un nouveau tube de 1,5 ml stocké sur de la glace.
7. Poussez tout tissu incomplètement digéré qui reste sur le filtre par trituration répétée avec une pointe de pipette de 1 000 μL. Rincez deux fois le filtre à tamis avec 500 μL de tampon FACS et récupérez la suspension cellulaire résultante dans la boîte de Pétri pour la combiner avec la suspension cellulaire de l’étape 1.6.
   NOTE : Si le cytomètre en flux utilisé est sensible aux débris, la suspension cellulaire de l’étape 1.7 peut être passée à travers un filtre à tamis de 70 μm ; Cependant, cela peut entraîner une perte de rendement des cellules nucléées.
8. Centrifuger les suspensions cellulaires à 300 x g pendant 5 min à 4 °C. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 1 mL de tampon FACS. Répétez cette étape de lavage une fois.
9. Remettre la pastille cellulaire en suspension dans 150 à 350 μL de tampon FACS, en fonction du nombre de coloration nécessaire (150 μL de tampon FACS par panneau de coloration).

2. Coloration du nerf sciatique et du DRG avec des anticorps marqués par fluorescence pour la cytométrie en flux

1. Transfère 100 μL du nerf sciatique ou de la suspension de cellules DRG dans un puits en forme de V dans une plaque de glace à 96 puits.
   NOTE : Des cellules monocolorées sont nécessaires pour tous les anticorps utilisés, car elles fourniront les contrôles nécessaires pour configurer la cytométrie en flux en ce qui concerne les gains de tension et la compensation du tube photomultiplicateur (PMT), ainsi que pour aider à distinguer la liaison spécifique de la liaison non spécifique.
2. Regrouper les suspensions cellulaires restantes (environ 50 μL par échantillon) des nerfs sciatiques ou des échantillons DRG, pour servir de contrôle non coloré.
3. Centrifugez la plaque à 400 x g pendant 5 min à 4 °C. Jetez le surnageant en retournant la plaque au-dessus d’un bac et en appliquant un coup sec du poignet, puis séchez-le doucement sur du papier absorbant.
4. Pour la coloration de surface, remettre en suspension chacune des pastilles cellulaires dans 20 μL de tampon FACS contenant les anticorps d’intérêt (CD45-A647, CD11b-PerCP/Cy5.5 et complexe majeur d’histocompatibilité [CMH] de classe II-Biotine) et incuber, à l’abri de la lumière, sur de la glace pendant 30 min.
   NOTE : (1) La dilution optimale des anticorps doit être déterminée avant l’utilisation en effectuant une série de dilutions conformément aux informations sur le produit du fabricant ; (2) Les taches non spécifiques peuvent être réduites par incubation avec Fc-block à cette étape, selon les instructions du fabricant ; et (3) la coloration de contrôle des isotypes n’est généralement pas nécessaire lors de l’utilisation d’anticorps primaires directement conjugués à un fluorophore et/ou lorsque le ou les antigènes d’intérêt produisent des populations distinctes.
5. Ajouter 130 μL de tampon FACS dans chaque puits et centrifuger la plaque à 400 x g pendant 5 min à 4 °C. Jeter le surnageant comme décrit précédemment (étape 2.3) et laver les pastilles de cellule deux fois avec 150 μL de tampon FACS.
   REMARQUE : Si vous utilisez un anticorps primaire non conjugué ou un anticorps primaire conjugué à la biotine, un réactif secondaire approprié, conjugué à un fluorophore, peut être ajouté à ce stade et les étapes 2.4-2.5 sont répétées. Dans le cas de ce protocole, la streptavidine-PE/Cy7 ou la streptavidine-PerCP a été utilisée pour détecter le CMH de classe II en combinaison avec CD45-A647/CD11b-PerCP/Cy5.5, ou en combinaison avec CD68-APC et F4/80-PE/Cy7, respectivement.
6. Pour la fixation, après la dernière étape de lavage, remettre en suspension les granules cellulaires dans 100 μL de paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS (pH 7,4). Incuber la plaque sur de la glace pendant 10 min, puis centrifuger à 400 x g pendant 5 min à 4 °C. Jeter le surnageant comme décrit précédemment (étape 2.3) et laver les pastilles de cellules une fois avec 150 μL de tampon FACS.
   Attention : Le paraformaldéhyde est toxique ; portez une protection appropriée telle que des gants et des lunettes, etc.
   REMARQUE : Remettre les pastilles de cellule en suspension dans 150 μL de tampon FACS et les conserver à l’abri de la lumière, à 4 °C, jusqu’à deux jours. Si aucune coloration intracellulaire n’est nécessaire, passez à l’étape 2.11 après avoir centrifugé la plaque à 400 x g pendant 5 min à 4 °C.
7. Pour la coloration intracellulaire, remettre les pastilles cellulaires en suspension dans 150 μL de tampon FACS + 0,5 % de détergent, et incuber à température ambiante, à l’abri de la lumière pendant 15 min. Centrifuger la plaque à 400 x g pendant 5 min à 4 °C. Jeter le surnageant comme décrit précédemment (étape 2.3) et laver une fois la pastille cellulaire avec 150 μL de tampon FACS + 0,5 % de détergent. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans 20 μL de tampon FACS + 0,5 % de détergent contenant les anticorps d’intérêt (CD68-APC, CD206-PE) et incuber, à l’abri de la lumière, à température ambiante pendant 30 min.
8. Ajouter 130 μL de tampon FACS + 0,5 % de détergent dans chaque puits et centrifuger la plaque à 400 x g pendant 5 min à 4 °C. Jeter le surnageant comme décrit précédemment (étape 2.3) et laver les granules de cellule deux fois avec 150 μL de tampon FACS + 0,5 % de détergent.
   REMARQUE : Si vous utilisez un anticorps primaire non conjugué ou un anticorps primaire conjugué à la biotine, un réactif secondaire approprié, conjugué à un fluorophore, peut être ajouté à ce stade et les étapes 2.9-2.10 répétées.
9. Remettre les granulés de cellule en suspension dans 150 μL de tampon FACS + 0,5 % de détergent et les conserver, à l’abri de la lumière, à 4 °C pendant deux jours maximum.
10. Remettre en suspension les granulés cellulaires avec 150 μL de tampon FACS + 0,5 % de détergent complété par 5 μg/mL4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) et incuber pendant 5 min à température ambiante, à l’abri de la lumière. Centrifuger la plaque à 400 x g pendant 5 min à 4 °C. Jeter le surnageant comme décrit précédemment (étape 2.3).
11. Remettre les pastilles de cellule en suspension dans 150 μL de PBS et les transférer dans un tube FACs correctement marqué. Conserver à température ambiante, à l’abri de la lumière, jusqu’à ce qu’il soit prêt à être analysé.
    NOTE : Après la remise en suspension dans le PBS, les cellules doivent être analysées dans les heures qui suivent, car le DAPI se dissocie lentement de l’ADN, entraînant une perte de signal.

3. Configuration de la cytométrie en flux et analyse des échantillons

1. Assurez-vous que le cytomètre en flux est équipé des lasers et/ou des ensembles de filtres appropriés pour mesurer les fluorophores utilisés pour colorer les cellules. Cela peut être déterminé dans la configuration par défaut du cytomètre sur le système. Dans le cas de ce protocole, les cellules ont été analysées à l’aide d’un cytomètre en flux équipé de trois lasers (405 nm, 488 nm et 633 nm) permettant de détecter ≤ 5 fluorophores.
2. Sélectionnez les canaux appropriés pour la détection des fluorophores d’intérêt. Tous les signaux fluorescents sont mieux détectés avec une amplification logarithmique.
3. Sélectionnez un débit approprié pour les échantillons. Ce paramètre peut varier en fonction du système utilisé et doit être déterminé empiriquement. Dans le cas de ce protocole, un débit de MED-HI (35-60 μL/min) a été utilisé pour éviter le colmatage de l’aiguille.
4. Sélectionnez le nombre total d’événements/cellules à collecter par échantillon. Le nombre minimum d’événements doit être de 1 000 000.
5. Créez des diagrammes de dispersion sous une feuille de calcul globale de l’aire de diffusion latérale (SSC-A) en fonction de l’aire de diffusion vers l’avant (FSC-A), ainsi que pour chaque fluorophore d’intérêt par rapport à FCS-A. Créez une vue statistique qui affichera le nombre d’événements et l’intensité fluorescente moyenne (MFI) pour les fluorophores sélectionnés.
6. Réglez la tension des canaux FSC-A et SSC-A, de sorte que les plus petites cellules s’insèrent dans les 10 % inférieurs gauches du nuage de points. Déterminez la fluorescence de fond et la fluorescence minimale de l’échantillon à partir des témoins non colorés des nerfs sciatiques ou des DRG. Déterminez la porte parente (P1) sur la base du nuage de points des témoins de coloration DAPI uniquement.
   NOTE : Il ne s’agit pas d’une porte de collecte, en partie en raison de la nature hétérogène de la population DAPI+ dans le système nerveux périphérique (SNP).
7. À l’aide des diagrammes de dispersion FSC pour chacun des fluorophores d’intérêt, ajustez les tensions de sorte que les cellules du témoin non coloré se trouvent dans le quart inférieur de leurs diagrammes de dispersion respectifs. Des portes sont ensuite créées au-dessus de cette région pour définir les cellules qui sont positives pour chacun des marqueurs/fluorophores respectifs. La mise en place d’une porte est confirmée par l’exécution de la commande monotache (étape 2.1).
   REMARQUE : La compensation des spectres d’émission qui se chevauchent peut être effectuée à ce stade ou appliquée a posteriori à l’aide du logiciel d’analyse approprié.
8. Une fois le cytomètre en flux installé, comme décrit, les échantillons peuvent être analysés.
9. Après l’analyse, les échantillons restants peuvent être éliminés et les fichiers FCS peuvent être exportés pour une analyse plus approfondie.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
C57BL/6 Mouse	Charles River	C57BL/6NCrl	<
DMEM (+1g/L glucose, glutamine, pyruvate)	Thermo	31885023	La source de ce matériel n’est pas importante
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
albumine sérique bovine (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153
type de collagénase 4	Worthington Biochemical Corp., US style='couleur :#1a202c ;taille de la police :12pt ;débordement :caché ;rembourrage :0px 3px ;alignement vertical :bas ;'>LS004188
Déoxyribonucléase (DNase) I du pancréas bovin I	Sigma-Aldrich	DN25-1g
Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)	Sigma-Aldrich	E6758
sérum de veau fœtal (FCS), inactivé par la chaleur	Sigma-Aldrich	F4135
anticorps contre CD11b-PerCP/Cy5.5	Biolegend	101228	Clone M1/70
Anticorps contre le CMH de classe II, biotinylé	Biolegend	107603	Cloner M5/114.15.2
Anticorps contre CD45-A647	Biolegend	107603	Clone 30-F11
Streptavidin-PE/Cy7	Biolegend	405206	Utilisé pour détecter la biotine MHCII avec CD45-A647 et CDllb-PerCP/Cy5.5
Streptavidin-PerCP	Biolegend	405213	Utilisé pour détecter la biotine MHCII avec CD68-APC et F4/80-PE/Cy7
Triton-X 100	Sigma-Aldrich	T8787
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542-1MG	Diluer dans PBS à un 50x et stocker à 4 °C dans l’obscurité
Tamis de dissociation cellulaire - kit de broyeur de tissus	Sigma-Aldrich	CD1
Plaques en V, 96-wells	Greiner/Sigma	M8185
tube à fond rond en polystryenne de 5ml, 12x75mm	BD Biosciences	352008
60x15mm boîte de Pétri	Greiner/Sigma	Z643084
BD LSR II Cytomètre de flux	BD Biosciences	<

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