Imagerie in vivo de la rétine de souris par tomographie par cohérence optique

Résumé

Source : Jagodzinska, J., et. al., Tomographie par cohérence optique : imagerie des cellules ganglionnaires rétiniennes de souris In Vivo. J. Vis. Exp. (2017)

Dans cette vidéo, nous démontrons l’utilisation de la tomographie par cohérence optique dans le domaine spectral (SD-OCT) pour imager les couches rétiniennes et évaluer les changements structurels dans un modèle de souris génétiquement modifié avec neuropathie optique.

Protocole

<

p style='line-height :1.380000000000001 ;margin-bottom :6pt ;margin-top :0pt ;text-align :justify ;' dir='ltr'>Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le conseil d’examen vétérinaire JoVE.

1. Préparation

de la souris

1. Dilatation et immobilisation des yeux
   1. Au moins 15 min avant l’acquisition des données, instillez 10 % de gouttes ophtalmiques de phényléphrine dans les yeux de la souris, retirez l’excédent et instillez 0,5 % de gouttes ophtalmiques de tropicamicide.
      NOTE : La première dilatation peut être effectuée en une seule fois pour toutes les souris qui seront testées lors de la séance. Assurez-vous que les liquides sont à température ambiante.
   2. Immédiatement après avoir induit une anesthésie générale (étape 1.2), administrez des gouttes ophtalmiques de chlorhydrate d’oxybuprocaïne à 0,4 %, en les maintenant en place pendant 3 secondes pour anesthésier et immobiliser les yeux. Ensuite, essuyez les gouttes et répétez l’instillation de 10 % de phényléphrine et de 0,5 % de tropicamide pour vous assurer que les yeux sont bien dilatés.
      NOTE : Assurez-vous que les liquides sont à température ambiante et que la souris n’avale pas l’oxybuprocaïne.
2. General anesthesia
   1. Préparez une solution anesthésique de kétamine (20 mg/mL) et de xylazine (1,17 mg/mL) dans une solution saline. Conserver à 4 °C pendant 2 semaines maximum.
   2. Environ 5 minutes avant le test, injecter par voie intrapéritonéale 5 à 10 μL de solution anesthésique pour 1 g de masse corporelle, en fonction de l’âge et de la taille de la souris.
      REMARQUE : Les souris jeunes et/ou minces ont besoin de moins d’anesthésie, prennent moins de temps pour s’anesthésier, mais se réveillent aussi plus rapidement. Ici, 8 μL/g (160 mg/kg de kétamine, 9,33 mg/kg de xylazine).
   3. En option, lubrifiez les yeux avec des gouttes oculaires visqueuses ou un gel ophtalmique pour éviter la sécheresse cornéenne.

2. positionnement de la souris

1. Lubrifiez les yeux avec des gouttes ophtalmiques à base de glycol visqueux pour hydrater la cornée.
   NOTE : Si les yeux semblent secs Pendant l’examen, réappliquez les gouttes ophtalmiques.
2. Enveloppez la souris dans une feuille de gaze chirurgicale pour la garder au chaud.
3. À l’aide d’une éponge ou d’une mèche en coton, appliquez une fine couche d’un gel ophtalmique contenant 0,3 % d’hypromellose sur chaque œil, afin de minimiser la réfraction de la lumière, d’éviter les opacités et de sécuriser l’hydratation de la cornée. Ce faisant, écartez les cils et les moustaches.
4. Positionnez la souris dans la cassette, la tête droite et pointant vers l’avant.
5. Ouvrez doucement la pince de la barre de morsure et placez la barre dans la bouche ; Utilisez la muserolle pour sécuriser la position.
   REMARQUE : Assurez-vous que La barre d’occlusion se trouve au milieu de la cassette.
6. Placez un rouleau de coton sous le côté droit (gauche) si l’œil droit (gauche) est testé.
7. Tout en gardant la pointe de visée à clipser sur l’objectif spécifique à la souris, amenez-la vers l’œil en tournant la vis du traducteur Z dans le sens inverse des aiguilles d’une montre.
8. En tournant et en faisant pivoter la cassette et en tournant la barre d’occlusion et les vis du traducteur X, préréglez la position de la souris ; L’objectif est que l’œil droit regarde directement dans le cristallin, et ainsi aligner les axes optiques des yeux et du cristallin.
   NOTE : Si la souris est trop haute ou trop basse, la vis du traducteur en Y doit être utilisée en premier.
9. Choisissez le premier scan dans l'« Examen », cliquez sur « Commencer à viser » et effectuez d’autres réglages manuels pour l’imagerie rétinienne.
   1. À l’aide de la vis Z-translator, déplacez la rétine verticalement sur le panneau de gauche (Figure 1, Horizontal B-scan Alignment) et horizontalement sur le panneau de droite (Figure 1, Vertical B-scan Alignment).
   2. Faites pivoter la cassette pour placer l’ONH au milieu du panneau droit en déplaçant l’ONH vers le haut ou vers le bas. Utilisez la vis de la barre d’occlusion pour redresser la rétine sur le panneau droit. Faites pivoter la cassette pour positionner l’ONH au milieu du panneau gauche.
   3. Utilisez la vis X-translator pour niveler la rétine sur le panneau gauche. En gardant à l’esprit la fonction principale de chaque modulateur, ajustez davantage la position de la rétine pour centraliser l’ONH.
      REMARQUE : Utilisez la vis du traducteur en Y pour déplacer l’ONH de haut en bas sur le panneau droit, si nécessaire. La position peut être affinée à tout moment entre les balayages.

3. Imagerie SD-OCT de l’ONH et du Retina

1. Une fois que vous êtes satisfait des ajustements, cliquez sur « Démarrer l’instantané » pour commencer l’analyse SD-OCT.
   1. Si une imagerie 3D n’est pas requise, décochez l’option OCU.
2. Enregistrez l’analyse et le rapport.
3. Passez aux prochaines analyses.
4. Pour imager le deuxième œil, après avoir rétracté l’objectif, tournez la cassette en conséquence et répétez les étapes 2.6 à 3.3.

4. Achèvement de l’acquisition

1. Lorsque l’acquisition est terminée, retirez la souris de la cassette, appliquez un gel ophtalmique contenant 0,3 % d’hypromellose sur chaque œil et placez la souris sur une plaque chauffante pour vous réveiller.
2. Après la dernière acquisition, fermez le logiciel et éteignez l’ordinateur et la machine OCT (bouton d’alimentation).
3. Nettoyez la cassette avec un désinfectant.

5. Analysis

1. Pour la mesure de l’épaisseur de la couche rétinienne, utilisez le logiciel de segmentation automatisé fourni par le fabricant.
   1. Cliquez sur « Patient », choisissez l'"Examen » souhaité dans la liste, puis cliquez sur l’option « Examiner l’examen ».
   2. Chargez les données OCT souhaitées dans le logiciel OCT en cliquant avec le bouton droit de la souris sur l’icône du dossier dans l’analyse souhaitée.
   3. Faites un clic droit sur le B-scan ; configurer les pieds à coulisse en activant jusqu’à 10 pieds à coulisse de mesure ; et entrez leurs noms, angles et couleurs.
   4. Choix de l’étrier souhaité par un clic droit sur le B-scan ; Placez-le en conséquence sur la rétine pour la mesure.
      NOTE : Pour les balayages centrés sur l’ONH, réglez 5 pieds à coulisse de chaque côté de celui-ci, équidistants les uns des autres. Pour l’analyse péripapillaire, assurez-vous que l’étrier n’est pas placé trop loin de l’ONH. Pour le balayage radial, analysez 10 images par balayage qui ont été choisies par le logiciel OCT. Leurs numéros se trouvent dans le dossier « Rapports ».
   5. Enregistrez les résultats pour analyse dans un tableur en cliquant avec le bouton droit de la souris sur le B-scan et en cliquant sur « Enregistrer les résultats ».
      NOTE : Les résultats se trouvent dans le même dossier que les données de numérisation.
2. Vous pouvez également utiliser la macro d’étrier maison, « MRI Retina Tool », développée pour un programme de traitement d’images open source (voir le tableau des matériaux).
   1. Assurez-vous que les macros « MRI Retina Tool » et « Modify Polygon Section Tool » sont actives. Chargez l’image. Cliquez sur le bouton m pour commencer la mesure.
      REMARQUE : La macro crée automatiquement une cassette de mesure de 0,2 mm de long des deux côtés de l’ONH. Chaque cassette contient 5 points de mesure qui fonctionnent comme des pieds à coulisse. Leur position latérale est immuable et est adaptée aux péripapilles dans les balayages radiaux. La position horizontale des cassettes est prédéfinie pour mesurer l’épaisseur RNFL/GCL, mais elle est facilement modifiable pour mesurer la couche complexe GC à la place. Si la qualité de numérisation est mauvaise, la position horizontale doit être ajustée ou l’image doit être exclue de l’analyse.
   2. Pour un réglage horizontal, cliquez sur le bouton e. Dans la nouvelle fenêtre « ROI Manager », choisissez la première cassette.
   3. Cliquez sur le bouton du polygone bleu et ajustez la position de la première cassette en cliquant sur les bords de la couche mesurée dans l’image.
   4. Répétez l’opération pour la deuxième cassette en la choisissant d’abord dans la fenêtre « ROI Manager », puis en cliquant sur l’image appropriée. Cliquez sur le bouton r pour remesurer. Affichez les résultats dans la fenêtre « Mesures ».
      NOTE : Les résultats peuvent être copiés à tout moment dans un tableur. Ils contiennent les valeurs suivantes pour la cassette droite (r), la cassette gauche (l) et le total : Intden - densité intégrée dans la cassette ; Aire : aire de la mesure, en mm2 ; Len : longueur de l’étrier à l’intérieur de la cassette, en mm ; Mean : intensité moyenne du signal à l’intérieur de la cassette ; et Std : erreur type de l’intensité moyenne du signal.
   5. Passez à l’image suivante.
   6. Analysez davantage les données dans un tableur.
      REMARQUE : Pour trouver l’épaisseur moyenne du calque, prenez les dix valeurs Len.

Résultats

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Mice
Opa1delTTAG mouse	Institut des neurosciences de Montpellier, INSERM UMR 1051, France	- style='background-color :#ffffff ;color :#1a202c ;font-size :10pt ;overflow :hidden ;padding :0px 3px ;vertical-align :bottom ;white-space :normal ;word-wrap :break-word ;wrap-strategy :4 ;'>Opa1 knock-in mice portant la mutation OPA1 c.2708_2711delTTAG sur fond C57Bl6/J
Equipment
EnVisu R2200 SD-OCT Imaging System	Bioptigen, Leica Microsystems, Allemagne	-	Système de tomographie par cohérence optique dans le domaine spectral
EnVisu R2200 SD-OCT Imaging System Software	Bioptigen, Leica Microsystems, Allemagne	-	Logiciel d’acquisition et d’analyse OCT
ImageJ 1.48v	Wayne Rasband, National Institutes of Health, États-Unis	-	Logiciel d’analyse, nécessite le téléchargement et l’installation de deux macros maison : http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Retina_Tool
Plaque chauffante autorégulante	Bioseb, France	BIO-062	Protection contre l’hypothermie
Supplies
Gauze pads 3"x3"	Curad, États-Unis	CUR20434ERB	Protection contre l’hypothermie
applicateur à embout en coton à double extrémité	Essence of Beauty, CVS Health Corporation, États-Unis	-	Application de gel
Cotton Twists	CentraVet, France	T.7979C.CS	Positionnement de la souris
Réactifs et médicaments	<
Néosynéphrine Faure 10 %	Laboratoires Europhtha, Monaco	-	Dilatation des yeux
Mydriaticum 0.5 %	Laboratoires Théa, France	3397908	Dilatation des yeux
Cebesine 0.4 %	Laboratoire Chauvin, Bausch&Lomb, France	3192342	Anesthésie locale
Imalgene 1000	Merial, France/CentraVet, France	IMA004	Anesthésie générale
Rompun	Bayer Healthcare, Allemagne/CentraVet, France	ROM001	Anesthésie générale, analgésie, relaxation musculaire
NaCl 0,9 %	Laboratoire Osalia, France	103697114	Sérum physiologique
Systene Ultra	Alcon, Novartis, États-Unis	-	Hydratation des yeux
GenTeal'	Alcon, Novartis, États-Unis	-	Gel ophtalmique pour minimiser la réfraction de la lumière et les opacités
Aniospray Surf 29	Laboratoires Anios, France	59844	désinfectant

< style='couleur-de-fond :#ffffff ;débordement :caché ;rembourrage :0px 3px ;alignement vertical :bas ;'> < style='couleur-de-fond :#ffffff ;débordement :caché ;rembourrage :0px 3px ;alignement vertical :bas ;'> style='couleur-de-fond :#ffffff ;débordement :caché ;rembourrage :0px 3px ;alignement vertical :bas ;'>