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Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par l’examen éthique animal approprié comité.
1. Time-Lapse Imaging
- Microscope Setup
- Réglez une chambre climatique placée sur la platine d’un microscope confocal inversé à 37 °C et 5 % d’atmosphère de dioxyde de carbone. Utilisez un détecteur hybride pour réduire l’intensité du laser et améliorer la viabilité cellulaire. Pour une analyse détaillée, utilisez un objectif sec à distance de travail extra-longue 40X avec une ouverture numérique de 0,6 ou plus.
Note : Tous les composants du microscope doivent être préchauffés à 37 °C pendant 2 à 3 h avant l’imagerie afin de fournir une mise au point stable pendant le processus d’imagerie.
- Slice Imaging
- Sélectionnez une tranche de cerveau pour l’imagerie à partir de la plaque à 6 puits contenant les inserts de membrane à l’aide d’un microscope à fluorescence inversée.
Attention : Évitez une exposition prolongée à la lumière ultraviolette car cela pourrait provoquer des photodommages cellulaires.
NOTE : Sélectionnez une tranche avec des neurones uniques brillants dans la SVZ supérieure (zone sous-ventriculaire) migrant radialement vers la surface piale de la tranche. De fins processus fluorescents des cellules gliales radiales qui couvrent l’ensemble de la CP (plaque corticale) indiquent un échafaudage glial radial intact, qui est utilisé par les neurones corticaux en migration radiale. - Transférez l’insert membranaire avec la tranche, qui a été sélectionnée pour l’imagerie en accéléré, dans une boîte à fond en verre de 50 mm de diamètre contenant 2 ml de milieu de culture en tranches à l’aide d’une pince. Placez la parabole dans la chambre climatique du microscope confocal.
- Réglez la résolution sur 512 x 512 pixels et augmentez la vitesse de balayage de 400 Hz à 700 Hz afin d’augmenter la fréquence d’images d’environ 1,4 à environ 2,5 images par seconde, respectivement. N’utilisez pas plus de deux fois la moyenne. Définissez un empilement z à travers la région électroporée (généralement 400-100 μm) avec une taille de pas de 1,5 μm. Collectivement, ces paramètres permettent d’obtenir une résolution et une luminosité suffisantes de l’image tout en maintenant les dommages photographiques faibles lors de l’acquisition. Commencez la série time-lapse en prenant une pile z toutes les 30 min.
NOTE : L’exposition prolongée de la tranche à la lumière laser induira des photodommages réduisant la viabilité des cellules. Ajustez le temps d’exposition à la lumière laser en conséquence. - Analysez des séries time-lapse à l’aide du logiciel ImageJ (https://imagej.nih.gov/iij/) ou équivalent.