Ablation sélective au laser d’un seul neurone chez une larve de poisson-zèbre à l’aide d’un microscope confocal

Résumé

Source : Morsch, M., et al., Déclenchement du stress cellulaire et de la mort à l’aide de la microscopie confocale laser UV conventionnelle. J. Vis. Exp. (2017)
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p style='line-height :1.380000000000001 ;margin-bottom :0pt ;margin-top :0pt ;text-align :justify ;' dir='ltr'>Dans cette vidéo, nous explorons la technique de l’ablation au laser UV de haute intensité pour cibler et étudier avec précision les neurones individuels chez le poisson-zèbre transgénique. Nous montrons comment préparer, immobiliser et visualiser les réponses neuronales, en mettant en évidence la dynamique cellulaire des blessures et de la récupération.

Protocole

1. Préparer des solutions pour l’intégration du poisson-zèbre dans l’agarose.
   1. Préparez une solution d’anesthésie en ajoutant 4 g/L de MS222 (solution mère de tricaïne, pH 7.0) goutte à goutte dans une boîte de Pétri contenant de l’eau d’œuf. Une dose de 50 mg/L est un point de départ recommandé (Figure 1A).
   2. Préparez un bouillon d’agarose à bas point de fusion (0,8 à 1,5 %) dans de l’eau d’œuf et aliquotez-le dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 ml. Placez une aliquote dans un bloc chauffant préchauffé (38 - 40 °C) et laissez-la s’équilibrer à la température réglée (~ 30 min ; Figure 1B).
   3. Facultatif : Pour une imagerie à plus long terme (> 4 h), préparez un petit cercle d’agarose dans la boîte de Pétri à fond de verre de 35 mm et laissez-le durcir.
      REMARQUE : Cette étape supplémentaire a été efficace pour éviter tout mouvement de la goutte entière d’agarose avec le poisson-zèbre sur de plus longues périodes.
      1. Pour ce faire, placez ~ 300 μL d’agarose le long du cercle intérieur du plat à fond de verre pour préparer un cercle en forme de beignet avec une petite ouverture au milieu dans laquelle placer le poisson (étape 1.5.3).
2. Montez le poisson-zèbre dans de l’agarose pour la microscopie.
   1. Sélectionnez 1 à 3 des poissons pré-sélectionnés pour l’ablation et anesthésiez les larves en les transférant (à l’aide d’une pipette de transfert) dans une boîte avec la solution d’anesthésie (étape 1.4.1 ; Figure 1C ; environ 5 min).
      REMARQUE : Les poissons sont anesthésiés lorsqu’ils présentent un mouvement operculaire peu profond et une fréquence cardiaque réduite et ne présentent plus une réponse d’évasion évoquée par le toucher (TEER ; incapacité à nager après avoir touché doucement leur queue avec une brosse). Assurer une anesthésie appropriée pour le traitement éthique du poisson et pour prévenir les contractions lors du transfert dans l’agarose ou de l’exposition à la lumière fluorescente.
   2. Une fois l’anesthésie confirmée, aspirez une larve à l’aide d’une pipette réglable (avec une pointe coupée de 200 μL réglée sur ~ 30 μL) et laissez-la couler au fond de la pointe. Transférez la larve dans de l’agarose préchauffée (étape 1.4.2) en libérant une goutte du liquide avec la larve dans l’agarose (essayez de minimiser la quantité d’eau de l’œuf qui entre dans l’agarose ; Figure 1D).
   3. Aspirez le poisson entouré d’agarose. Distribuez-le rapidement dans le plat à fond de verre de 35 mm préalablement préparé.
   4. Utilisez un microscope de dissection et un pinceau standard (liner long, taille 1) pour positionner l’animal dans l’agarose sur le côté (tête à gauche) de sorte que le corps et la queue soient plats (Figure 1E). Si vous travaillez avec plusieurs poissons, alignez tous les poissons dans la boîte de manière à ce qu’ils soient facilement localisés à l’aide du microscope confocal plus tard.
      NOTE : Effectuez rapidement cette procédure de positionnement et d’alignement (cela peut nécessiter un peu de pratique, car l’agarose commence à prendre immédiatement après l’exposition à des températures plus froides).
   5. Laissez le poisson incrusté d’agarose pendant 10 à 15 minutes jusqu’à ce que l’agarose soit bien prise. Complétez soigneusement la boîte de Pétri de 35 mm avec ~ 2 mL d’eau d’œuf contenant de la tricaïne (Figure 1F).

2. Configurer le microscope confocal et les paramètres d’imagerie

1. Place la boîte de Pétri avec la larve incrustée sur la platine du microscope confocal et concentre-toi sur la face dorsale de la moelle épinière de l’animal (en utilisant le fond clair). Examinez l’animal sous le grossissement approprié (40X) et le réglage fluorescent et visualisez la structure qui vous intéresse (e.g.,intensité de fluorescence des neurones marqués ou mouvement microglial) pour confirmer que tous les paramètres d’imagerie sont conformes aux besoins pour l’ablation ultérieure (Figure 2). Nous utilisons régulièrement l’objectif 40X pour réaliser nos études en accéléré.
2. Facultatif : Pour effectuer une étude time-lapse pendant plusieurs heures, il est conseillé d’enregistrer un seul ou quelques points temporels avant l’ablation afin d’établir la réponse physiologique imperturbable de la cellule et de son environnement (par exemple, mouvement microglial pour établir la vitesse et la motilité de base).
3. Déterminer l’épaisseur de la structure d’intérêt pour l’ablation laser UV.
   1. À l’aide du lecteur z, vérifiez le haut et le bas de la structure qui vous intéresse (par exemple, la cellule soma) en faisant manuellement la mise au point vers le haut et vers le bas. Notez le plan z qui sera ablaté (e.g., le centre de la cellule).
      NOTE : D’expérience, cette méthode s’est avérée plus efficace en ciblant les neurones de la moelle épinière qui étaient marqués de manière brillante (un rapport signal/bruit élevé qui permet une visualisation facile en accéléré après l’ablation ; e.g., Figure 4) et en ablant le milieu du soma cellulaire. La fluorescence du noyau cellulaire peut être un avantage pour assurer un ciblage correct et une efficacité d’ablation élevée.

3. effectuer une ablation laser ciblée des cellules individuelles chez le poisson-zèbre Moelle épinière

REMARQUE : Pour cette approche d’ablation et de visualisation, un microscope confocal (Leica SP5) a été utilisé. La procédure d’ablation à l’aide d’une diode de 405 nm pour la destruction spécifique à la cellule est détaillée selon le logiciel (Leica Application Suite, v2.7.3.9723). Cependant, tout microscope confocal conventionnel équipé d’un laser de 405 nm et d’un FRAP (récupération de fluorescence après photoblanchiment) ou d’un module de blanchiment permettra d’effectuer les mêmes manipulations cellulaires, mais potentiellement avec des réglages, des paramètres et des noms légèrement différents.

1. Démarrez l’assistant FRAP en cliquant sur le menu déroulant en haut du menu du logiciel (Figure 3A, 1 and 2). Observez une nouvelle fenêtre avec différentes étapes qui permet de configurer les paramètres spécifiques pour l’ablation laser (Figure 3B, 3).
2. Déterminez les paramètres de l’image pour l’approche d’ablation en sélectionnant le format, la vitesse de balayage (Figure 3B, <span style='font-family :Arial,sans-serif ;font-size :12pt ;font-style :normal ;font-variant :normal ;text-decoration :none ;vertical-align :baseline ;white-space :pre-wrap ;'>4), et la moyenne (Figure 3B, 5). Un format d’image de 1 024 x 1 024 à une vitesse de balayage de 400 Hz et une moyenne de ligne de 4 était le plus applicable.
   REMARQUE : Il n’est généralement pas nécessaire de modifier la détection spectrale (comme les paramètres d’excitation ou d’émission), car ils ont été déterminés lors de l’acquisition précédente.
   1. Si le plan z pour l’ablation n’a pas déjà été sélectionné (comme décrit à l’étape 2.4.), appuyez sur le bouton « Live » et faites la mise au point sur l’échantillon jusqu’à ce que la structure fluorescente ou le plan z souhaité qui va être ablaté soit net.
3. Une fois les paramètres généraux de l’image définis, accédez à l’étape « Bleach » (Figure 3C, 6) pour contrôler les composants d’ablation spécifiques.
   REMARQUE : A combinaison de l’intensité laser (Figure 3C, 8), la vitesse de balayage et la moyenne qui a été définie à l’étape 3.2 (Figure 3B, 4 et 5), ainsi que le nombre de répétitions qui seront définies à l’étape 3.5 (Figure 3E, 12), déterminera le temps de séjour global du laser UV au ROI, et donc, l’efficacité du blanchiment.
   1. Engagez le laser 405-nm en l’activant pour la procédure de blanchiment (Figure 3C, 8).
      REMARQUE : Le plus grand succès avec les paramètres susmentionnés a été obtenu avec des intensités laser de 405 nm comprises entre 60 et 80 % dans notre configuration expérimentale. N’oubliez pas que cette puissance de sortie laser est spécifique à l’instrument et qu’elle diffère pour chaque configuration confocale.
   2. Utilisez l’option « zoom avant » (Figure 3C, 7) maximiser l’intensité du blanchiment au retour d’intérêt sélectionné en réduisant le champ de balayage, maximisant ainsi le temps de séjour. Vous pouvez également utiliser l’option « Point de blanchiment » du logiciel de votre choix pour ce processus.
4. Sélectionnez un ou plusieurs ROI (Figure 3D, 10) pour l’ablation en utilisant l’un des outils de dessin de la fenêtre d’acquisition d’images (Figure 3D, 9). Ciblez l’extrémité axonale, par exemple, avec l’outil de dessin circulaire d’environ 4 à 8 μm.
   NOTE : La zone d’ablation est réglable d’un seul pixel à une zone plus grande, en fonction de l’application.
5. Après avoir établi le retour sur investissement, sélectionnez le bouton « Time Course » (Figure 3E, 11) et confirmez le nombre de cycles pendant lesquels les ROI seront scannés/ablatés (Figure 3E, 12). Choisissez les cadres « Pré-blanchiment » et « Post-blanchiment » comme vous le souhaitez pour permettre une vue d’ensemble de l’image juste avant et immédiatement après le processus de blanchiment.
6. Après avoir établi tous les paramètres d’ablation nécessaires, appuyez sur « Run Experiment » (Figure 3E, 13) et surveiller l’efficacité de l’ablation.
   NOTE : Dans notre configuration FRAP, une seule image sera prise avant et après le cycle FRAP avec l’excitation laser appropriée (e.g., excitation à 488 nm pour les cellules exprimant l’EGFP). Ces images pré et post-ablation permettent de juger rapidement de la satisfaction du blanchiment du retour sur investissement et de l’efficacité des paramètres d’ablation choisis.
7. Répétez le processus en ajustant l’intensité du laser (Figure 3C, 8), vitesse de balayage et moyenne (Figure 3B, 4 et 5), et les répétitions (Figure 3E, 12) au cas où le retour sur investissement sélectionné présente toujours une intensité de fluorescence élevée après l’achèvement du FRAP cycle.

Résultats

Matériaux