Suivi morphologique et physiologique des sphéroïdes tumoraux par tomographie par cohérence optique

Résumé

Source : Huang, Y. et al., Surveillance morphologique et physiologique longitudinale des sphéroïdes tumoraux tridimensionnels à l’aide de la tomographie par cohérence optique. J. Vis. Exp. (2019)

Cette vidéo démontre l’utilisation de la tomographie par cohérence optique (OCT) pour surveiller les sphéroïdes tumoraux dans une plaque multi-puits en capturant des images en coupe transversale haute résolution. En analysant les réflexions lumineuses des structures cellulaires, l’OCT construit des modèles 3D pour évaluer les caractéristiques morphologiques telles que la taille et la forme, tout en distinguant les cellules viables des cellules non viables en fonction des changements de diffusion de la lumière au fil du temps.

Protocole

1. Préparation des cellules

1. Obtenir des lignées cellulaires auprès d’un fournisseur qualifié.
   REMARQUE : Vérifiez que les cellules des lignées cellulaires d’intérêt peuvent former des sphéroïdes dans le milieu de culture ou à l’aide d’un substrat (matrice de membrane basale comme Matrigel). Examinez la littérature ou effectuez une série d’une pré-expérience pour une vérification.
2. Décongeler les cellules congelées en suivant la procédure spécifique fournie par le fournisseur de la lignée cellulaire. Une procédure générale peut être trouvée ailleurs.
3. Cultivez les cellules pour 1-2 passages dans des flacons de culture de 25 cm². Les cellules sont ensuite prêtes à être utilisées pour la culture cellulaire 3D.
4. Surveillez quotidiennement l’état de santé des cellules et maintenez-les dans un incubateur dans des conditions standard (37 °C, 5 % CO₂, 95 % d’humidité). Actualisez le support si nécessaire.
   REMARQUE : Le milieu de culture se compose du milieu Modified Eagle de Dulbecco (DMEM) (4,5 g/L de glucose), de 1 % d’antibiotique-antimycosique et de 10 % de sérum de veau fœtal (FBS). Sous-cultures avant qu’elles n’atteignent la confluence dans le ballon de culture. Suivez les directives de culture cellulaire fournies par le fournisseur. Une procédure générale peut être trouvée ailleurs.
5. Effectuer une culture cellulaire 3D dans des plaques multi-puits selon le protocole général suivant.
   1. Retirer le milieu de culture de la fiole de culture et le laver avec une solution saline stérilisée tamponnée au phosphate (PBS, chauffée à 37 °C).
   2. Remettre les cellules en suspension en ajoutant 1 mL de trypsine éthylènediaminetétraacétique (EDTA, 0,5 %) dans le ballon pendant 3 min. Ensuite, ajoutez du milieu de culture pour diluer la trypsine.
   3. Transvasez la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger de 15 ml et centrifugez pendant 5 min à 500 x g et à température ambiante.
   4. Retirer le surnageant et remettre les cellules en suspension avec 4 mL de milieu de culture préchauffé. Pipeter une goutte de l’échantillon sur un hémocytomètre pour le comptage des cellules afin de déterminer la concentration cellulaire. Diluez les cellules à la concentration appropriée pour l’ensemencement (, p. ex., 3 000 cellules/ml).
      REMARQUE : Optimisez la concentration cellulaire initiale du sphéroïde pour chaque lignée cellulaire et chaque type de plaque multipuits (96 puits, 384 puits ou 1536 puits).
   5. Placez les cellules dans une plaque multipuits à fond rond à fixation ultra-faible (ULA). Ajouter 200 μL de suspension cellulaire dans chaque puits à une concentration de 3 000 cellules/mL de sorte que chaque puits ait environ 600 cellules.
   6. À température ambiante (RT), centrifugez toute la plaque à l’aide d’un adaptateur de plaque pendant 7 min, juste après l’ensemencement, à une vitesse de 350 x g ou à la vitesse la plus basse disponible.
      REMARQUE : La centrifugeuse aide à rassembler les cellules au centre du puits pour faciliter la formation d’un sphéroïde unique et uniforme. L’étape de centrifugation n’est effectuée qu’une seule fois au début pour former les sphéroïdes tumoraux. Il ne se répétera pas lorsque les sphéroïdes tumoraux commenceront à se développer.
   7. Maintenir la plaque multipuits à 37 °C et 5 % de CO₂ dans un incubateur de culture et rafraîchir le milieu de culture tous les 3 jours.
      REMARQUE : Le temps de croissance peut varier selon les conditions de culture 3D. Dans notre étude, 3 000 cellules/ml sont utilisées pour les lignées cellulaires U-87 MG et HCT 116 dans des plaques à 96 puits, de sorte que le sphéroïde peut atteindre ~500 μm en 4 à 7 jours pour les cellules HCT 116. Sur la base du protocole général de culture 3D, envisagez d’ajouter des suppléments de milieu et des facteurs de croissance pour différents modèles de sphéroïdes.
   8. Effectuer une imagerie par tomographie par cohérence optique (OCT) des sphéroïdes tumoraux tous les 3 à 4 jours pour une étude longitudinale de leur croissance.
      REMARQUE : Les points temporels recommandés pour l’imagerie OCT sont le jour 4, le jour 7, le jour 11, le jour 14, le jour 18 et le jour 21.

2. Plateforme d’imagerie OCT à haut débit

REMARQUE : Voir Figure 1 pour plus de détails sur le système d’imagerie OCT personnalisé utilisé dans cette étude.

1. Choisissez une source lumineuse à large bande appropriée pour le système OCT pour l’imagerie des sphéroïdes tumoraux.
   REMARQUE : Ici, une diode superluminescente (SLD, Figure 1A, B) avec une longueur d’onde centrale de ~1 320 nm et une bande passante de 110 nm a été utilisée comme source lumineuse à large bande.
2. Construisez le bras de référence et le bras d’échantillonnage du système OCT en suivant les schémas (voir Figure 1A, B pour plus de détails). Le Table {TAG_258}} de Matériaux énumère les composants optiques nécessaires à la construction du système OCT. Assurez-vous que les longueurs de chemin optique du bras de référence et du bras d’échantillon sont étroitement adaptées.
3. Construisez le spectromètre, y compris un collimateur, un réseau, une lentille F-thêta et une caméra à balayage linéaire (Voir Figure 1C pour plus de détails sur la conception du spectromètre OCT. Sinon, sélectionnez un spectromètre commercial qui correspond à la longueur d’onde centrale de la source lumineuse. Assurez-vous que le spectromètre est correctement aligné pour couvrir toute la bande passante laser, pour obtenir une efficacité de collecte de photons élevée et pour permettre un lavage lent du motif d’interférence.
4. Caractérisez les performances du système OCT, y compris les paramètres suivants tels que la puissance du bras d’échantillonnage, la profondeur d’imagerie totale, la sensibilité dépendante de la profondeur, la résolution axiale, la profondeur de champ et la résolution latérale. Placez un réflecteur faible (, par exemple , un miroir avec un filtre à densité neutre) comme échantillon pour mesurer la sensibilité dépendante de la profondeur, la résolution axiale et la profondeur de champ. Placez une cible de carte de test de résolution de l’US Air Force (USAF) comme échantillon pour vérifier la résolution latérale.
5. Sélectionnez une platine de translation motorisée pour fournir un mouvement horizontal de la plaque multi-puits afin d’imager les sphéroïdes tumoraux dans différents puits (Voir Figure 1B). Utilisez un étage avec une plage de déplacement supérieure à 108 mm x 72 mm pour assurer un balayage complet de tous les puits de la plaque multipuits. Utilisez une platine de translation motorisée bidimensionnelle (2D) ou tridimensionnelle (3D) avec contrôle logiciel pour permettre la localisation précise de chaque puits et l’automatisation du système OCT pour l’imagerie à haut débit.
6. Utilisez un adaptateur de plaque ou concevez un support de plaque (par impression 3D) pour maintenir la plaque multipuits dans une position fixe.
7. Avant d’effectuer une imagerie OCT, corrigez l’inclinaison et la rotation de la plaque multipuits à l’aide d’une platine d’inclinaison 2D et d’une platine de rotation montée sur la platine de translation (Voir Figure 1D) pour minimiser la variation du plan de mise au point des différents puits. Utilisez D2, D11, B6, D6 et G6 comme puits de guidage lors de la surveillance de leurs positions relatives dans les images OCT (Figure 1A).
8. Ajustez la rotation de la plaque pour vous assurer que les bords sont parallèles à la direction du mouvement de la platine afin que les puits restent aux mêmes positions horizontales dans les images OCT (Figure 1E). Ajustez l’inclinaison de la plaque pour qu’elle soit parallèle à la table optique afin que les puits restent aux mêmes endroits verticaux pour l’imagerie OCT (Figure 1F).
   REMARQUE : Le réglage de l’angle d’inclinaison et de la mise au point permet d’optimiser la qualité de l’image OCT pour tous les puits. Cependant, les variations de la hauteur des milieux de culture dans différents puits peuvent provoquer des modifications du chemin optique, ce qui peut entraîner une défocalisation de l’image du sphéroïde. La mise au point automatique peut être mise en œuvre pour contrôler le plan focal de l’imagerie OCT afin d’obtenir une qualité d’image optimisée. L’étape d’ajustement ne résout pas la mauvaise qualité d’image OCT du sphéroïde tumoral en raison des problèmes suivants : le sphéroïde se décentrer en raison de l’emplacement initial de l’ensemencement ; élévation des sphéroïdes lorsqu’ils sont intégrés dans des matrices extracellulaires biofabriquées ; mauvaise qualité des plaques avec de grandes variations de hauteur des fonds de puits. Un contrôle logiciel supplémentaire avec des fonctions de mise au point automatique ou d’auto-alignement peut être mis en œuvre pour optimiser les performances du système d’imagerie OCT.
9. Pour collecter les données de chaque puits de manière séquentielle, un programme informatique personnalisé contrôle l’acquisition de l’image OCT et le mouvement de la scène.

3. Balayage OCT et traitement des sphéroïdes tumoraux

1. Le jour de l’imagerie OCT des sphéroïdes tumoraux, retirez la plaque multipuits de l’incubateur. Transférez-le sous le système d’imagerie OCT et placez-le sur l’adaptateur de plaque.
   REMARQUE : L’imagerie OCT des sphéroïdes tumoraux peut être réalisée avec le couvercle de la plaque de polystyrène fermé ou non. Cependant, les condensations d’eau sur le couvercle dues à l’évaporation des puits peuvent affecter la transmission de la lumière et déformer le trajet de la lumière, ce qui donne des images OCT moins optimales des sphéroïdes.
2. Ajustez la hauteur de la plaque en vous déplaçant le long de la direction z de l’étape de translation. Maintenir la position du plan focal à ~100–200 μm sous la surface supérieure de chaque sphéroïde, afin de minimiser l’effet du profil focal non uniforme en profondeur.
3. Dans le logiciel personnalisé, définissez une plage de balayage OCT appropriée (, par exemple , 1 mm x 1 mm) pour couvrir l’ensemble du sphéroïde de la tumeur en fonction de ses stades de développement. Cliquez sur Enregistrer les paramètres pour enregistrer le paramètre.
4. Utilisez le logiciel personnalisé pour acquérir des images OCT 3D des sphéroïdes tumoraux un par un pour tous les puits de la plaque contenant des sphéroïdes. Cliquez sur le bouton Preview pour afficher l’image d’aperçu et cliquez sur le bouton Acquire pour acquérir l’image OCT.
   REMARQUE : Assurez-vous que les données du sphéroïde OCT sont collectées lorsque la platine n’est pas en mouvement. Le sphéroïde est généralement situé au centre du puits de fond en U. Cependant, le sphéroïde peut être déplacé dans le milieu de culture lorsque l’étape s’accélère ou ralentit en raison de l’inertie du sphéroïde dans le milieu de culture.
5. Traitez des ensembles de données OCT 3D de sphéroïdes tumoraux pour générer des images structurelles OCT avec un code de traitement C++ personnalisé. Voir Figure 2A pour un organigramme du post-traitement des données OCT.
   REMARQUE : Voir Figure 3A pour les images structurelles 3D OCT générées.
   1. Calibrez la taille des pixels dans les trois dimensions. Redimensionnez les images structurelles OCT à des échelles corrigées.
      REMARQUE : La distance dans la direction axiale (direction z) des images OCT mesure la différence de chemin optique entre le bras de référence et le bras d’échantillonnage. Ainsi, l’indice de réfraction de l’échantillon (n) doit être pris en compte lors de l’étalonnage de la taille des pixels dans la direction axiale pour la mise à l’échelle. Dans notre étude, nous utilisons n = 1,37 comme indice de réfraction du sphéroïde tumoral.
6. Générez un collage d’images sphéroïdes à l’aide d’images OCT 2D dans trois plans XY, XZ et YZ en coupe transversale à travers le centroïde du sphéroïde. Voir Figure 4C–E pour la production représentative de collages d’images sphéroïdes. Effectuez un recalage d’image pour tous les sphéroïdes, à l’aide de la fonction MATLAB dftregistration, pour vous assurer que les centroïdes de tous les sphéroïdes sont situés à peu près au même endroit.
7. Obtenez un rendu 3D du sphéroïde à l’aide d’un logiciel commercial ou personnalisé.
   REMARQUE : Les étapes suivantes montrent comment obtenir le rendu 3D des sphéroïdes tumoraux à l’aide d’un logiciel commercial.
   1. Chargez les données OCT 3D dans le logiciel.
   2. Cliquez sur le panneau Surpass. Cliquez ensuite sur Ajouter un nouveau volume. Choisissez le mode Blend à utiliser pour le rendu 3D.
   3. Ajustez l’angle de vue en faisant glisser l’image à l’aide du pointeur de la souris.

4. Quantification morphologique de sphéroïdes tumoraux 3D

REMARQUE : Un code écrit sur mesure dans MATLAB traite cette quantification. Cliquez sur le bouton Exécuter pour lancer le processus. Voir Figure 2B pour l’organigramme des étapes de quantification morphologique des sphéroïdes.

1. Quantifiez le diamètre, la hauteur et le volume du sphéroïde.
   1. Sélectionnez des images OCT 2D dans trois plans de coupe XY, XZ et YZ qui traversent le centroïde du sphéroïde.
   2. Mesurez le diamètre et la hauteur du sphéroïde dans les plans XY et XZ, respectivement.
   3. Calculez le volume sphéroïde basé sur le diamètre en utilisant :

, avec une présomption de la forme sphérique de la tumeur.

2. Quantifiez le volume des sphéroïdes basés sur les voxels.
   1. Appliquez un filtre de moyenne 3D sur les données structurelles OCT du sphéroïde pour éliminer les taches.
   2. Segmentez les sphéroïdes tumoraux à l’aide du filtre de détection des bords Canny, image par image, avec un seuil approprié séparant la région du sphéroïde tumoral du fond du puits.
   3. Regroupez les voxels connectifs pour les données 3D (voir fonction intégrée : bwconncomp).
   4. Calculez la distance moyenne entre chaque voxel conjonctif du groupe et le centroïde sphéroïde (choisi manuellement), pour chaque groupe. Identifiez la région sphéroïde comme étant le groupe avec la distance moyenne minimale.
   5. Comptez le nombre de voxels dans la région du sphéroïde, puis multipliez par le volume réel d’un voxel individuel (volume/voxel), ce qui donne le volume total du sphéroïde.

5. Détection de sphéroïdes tumoraux 3D

REMARQUE : Dans un milieu homogène, l’intensité de rétrodiffusion OCT détectée en fonction de la profondeur (I(z}{TAG_689}})) peut être décrite par le Loi de Beer-Lambert :

{TAG_694}}

Où z{TAG_704}} représente la profondeur, μ est le coefficient d’atténuation optique, et I0 est l’intensité de l’incident pour l’échantillon. Par conséquent, le coefficient d’atténuation optique dérivé peut être exprimé comme suit :

Étant donné que les images OCT sont souvent tracées sur une échelle logarithmique, la pente du profil d’intensité OCT peut être récupérée pour calculer le coefficient d’atténuation optique. Voir Figure 2C pour un organigramme de la génération des cartes d’atténuation optique.

1. Effectuez une segmentation pour supprimer les régions indésirables en dehors du sphéroïde. Effectuez un filtre de moyenne 3D pour supprimer le bruit de chatoiement inhérent aux images OCT.
2. Obtenez des coefficients d’atténuation optique au pixel près en ajustant linéairement le profil d’intensité OCT à l’échelle logarithmique sur une certaine plage de profondeur (fenêtre mobile), en extrayant sa pente et en multipliant la pente par -1/2.
   REMARQUE : Le coefficient d’atténuation à chaque voxel dans la région sphéroïde segmentée est calculé sur la base de la pente du profil d’intensité OCT dans une fenêtre de profondeur de 10 voxels (~40 μm de profondeur), le voxel étant situé au milieu de la fenêtre.
3. Appliquez les méthodes ci-dessus (étapes 5.1 et 5.2) à chaque balayage axial d’une trame et à chaque trame d’un ensemble de données 3D contenant la région sphéroïde segmentée jusqu’à ce que les coefficients d’atténuation optique pour tous les voxels de la région sphéroïde segmentée soient calculés.
4. Effectuez le seuillage binaire pour mettre en évidence la région d’atténuation élevée.
   Mettez en surbrillance la carte d’atténuation optique binarisée sur l’image d’origine pour étiqueter la région des cellules mortes (fusion). Générez l’image 3D de la carte d’atténuation combinée pour visualiser la distribution 3D de la région des cellules mortes.

Résultats

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Système d’imagerie OCT dans le domaine spectral personnalisé			Développé dans notre laboratoire
{{}}Diode superluminescente (SLD)	Thorlabs	SLD1325
2 ×2 coupleur de fibre fusible monomode, 50 : Rapport de fractionnement de 50	AC Photonics	WP13500202B201
}Référence Arm
Tube d’objectif	Thorlabs
Thorlabs
{{}}TAG_73	Thorlabs	AC080-02 0-C
Objectif de mise au point	Thorlabs
Thorlabs
{{}}}{{TAG_104}TAG_103}Thorlabs	{{}}}{}} TAG_107}}
1D Translational Stage	Thorlabs
Thorlabs
{{}}{Poste pédestre	Thorlabs
Fourche de serrage	Thorlabs
Bras d’échantillonnage
Tube d’objectif	Thorlabs
Adapter	Thorlabs
Lentille collimatrice	Thorlabs	AC080-020-C
Galvanomètre	Thorlabs{{}TAG_195}}}
Lentille relais	Thorlabs	AC254-100-C	Deux lentilles relais pour fabriquer un télescope setup
Miroir triangulaire	Thorlabs
Miroir	Thorlabs
Objectif	Mitutoyo		{{ TAG_239}}
Poste de pédagogie	Thorlabs
Fourchette de serrage
Contrôleur de polarisation	Thorlabs		{{ TAG_269}}
Montage en cage de 30 mm	Thorlabs
Tige de cage	Thorlabs
		{{ TAG_299}}
Platine de translation motorisée 3D	Beijing Mao Feng Optoelectronics Technology Co., Ltd.	JTH360XY
2D Scène basculante
Scène de rotation	{{TAG_ 325}}
Porte-plaques			Imprimé en 3D
{Spectromètre
Tube d’objectif	Thorlabs{{TAG_ 355}}
Adapter	Thorlabs
Lentille de collimation	Thorlabs	AC080-020-C
{}}Gnotage	Wasatch	G = 1145 lpmm
F-theta lens	Thorlabs	FTH-1064-100
Caméra à balayage linéaire InGaAs	Capteur illimité	SU1024-LDH2
Composant de culture cellulaire{{TAG_ 414}}
HCT 116 Lignée cellulaire	ATCC	CCL-247
Flacon de culture cellulaire	SPL Life Sciences	70025
Pipette	Fisherbrand	14388100
Pointes de pipette	Sorenson Bioscience	10340{{}} TAG_459}}
Gibco GlutaMax DMEM	Thermo Fisher Scientific	10569044
Sérum fœtal de bovin, certifié, origine américaine	Thermo Fisher Scientific	16000044
Antibiotique-antimycosique (100X)	Thermo Fisher Scientific
Corning à fond rond transparent à 96 puits microplaque	Corning	7007
Gibco PBS, pH 7.4	Thermo Fisher Scientific	10010023
Gibco trypsine-EDTA (0,5 %)	Thermo Fisher Scientific	15400054
Forma Series II 3110 avec chemise d’eau CO2 incubateur	Thermo Fisher Scientific	3120		VWR	89428-750
Parafilm	Sigma-Aldrich{{ TAG_555}}	P7793
Pipettes de transfert	Globe Scientific	138080	{{ TAG_569- }}
Centrifugeuse	Eppendorf	5702 R	Pour centrifuger le tube de 15 ml
Centrifugeuse{{ TAG_583}}	NUAIRE	AWEL CF 48-R	Pour centrifuger la plaque à 96 puits
{}}TAG_593{TAG_594}}Olympus
Liste des PTOM commerciaux
Système SD-OCT	Thorlabs	Série Telesto
SDS -Système OCT	Wasatch Photonics	WP OCT 1300 nm
}Logiciel pour l’analyse de données{{TAG_ 637}}
Analyse d’image de base	NIH	ImageJ	Fiji fonctionne également.
Rendu 3D	Thermo Fisher Scientific	Amira	Logiciel commercial. Option 1
Rendu 3D	Bitplane	Imaris	. Variante 2. Utilisé dans le protocole
}Logiciel d’acquisition OCT			développé sur mesure en C++.
Contrôle de scène	Beijing Mao Feng Optoelectronics Technology Co., Ltd.	MRC_3	Incorporé dans le code d’acquisition OCT personnalisé
{{}}} Logiciel de traitement OCT			Développé sur mesure en C++. Utilisez le GPU. Incorporé dans le code d’acquisition OCT personnalisé.
Analyse morphologique et physiologique			Développé sur mesure dans MATLAB

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