Imagerie de polysomes isolés du cerveau d’une souris à l’aide de la microscopie à force atomique

Abstract

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p style='line-height :1.2 ;margin-bottom :0pt ;margin-top :0pt ;' dir='ltr'>Source : Lunelli, L., et al. Regarder les polysomes cérébraux avec la force atomique Microscopie. J. Vis. exp.(2016).

Cette vidéo montre l’imagerie des polysomes à l’aide de la microscopie à force atomique. Une feuille de mica enrobée d’ions nickel ancre l’ARN avec les ribosomes attachés. L’échantillon est lavé, séché et monté sur la platine du microscope. La pointe en porte-à-faux scanne la surface de l’échantillon, enregistrant les déviations du laser pour cartographier la topologie. Un logiciel est utilisé pour corriger les distorsions et visualiser les structures polysomiques à haute résolution.

Protocol

Attention : Pour éviter toute dégradation de l’ARN des échantillons, préparez tous les tampons en utilisant de l’eau traitée au DEPC afin de minimiser la contamination par la RNase.

1. Préparation de polysomes à partir de cerveaux entiers

{TAG_22}}Collecte de tissus cérébraux (15 min)
1. Euthanasier la souche de souris sauvage C57BL/6 avec du CO₂ asphyxie pendant 5 min. Disséquez soigneusement le cerveau du crâne, placez le tissu dans un tube de 1,5 ml et placez-le immédiatement dans de l’azote liquide. Conserver à -80 °C jusqu’à utilisation.
1. Préparation du lysat (30 min)
   1. Pulvériser tout le tissu cérébral à l’aide d’un mortier et d’un pilon sous azote liquide.
   2. Transférez environ 25 mg de poudre dans un tube de microcentrifugation froid et ajoutez immédiatement (pour éviter la décongélation du tissu pulvérisé) 0,8 ml de tampon de lyse (voir le tableau 1) et perturbez la cellule en pipetant de haut en bas 25 fois rapidement.
   3. Centrifuger le tube à 12 000 x g pendant 1 min à 4 °C pour granuler les débris cellulaires.
   4. Transférez le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifugation et maintenez le tube sur de la glace pendant 15 min.
   5. Centrifugez le tube à 12 000 x g pendant 5 min à 4 °C sur les noyaux de granules et les mitochondries.
   6. Transférez le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifugation.
   7. Conservez le surnageant à -80 °C pendant 6 mois maximum ou utilisez-le immédiatement.
2. Préparation et centrifugation par gradient de saccharose (2 h et 30 min)
   1. Laver abondamment les tubes d’ultracentrifugeuse avec de l’eau exempte de RNase (eau traitée au diéthylpyrocarbonate (eau DEPC) ou commerciale) et 3 % H₂O₂/DEPC H_{2{{TAG_ 126}}}O.
   2. Placez les tubes sur de la glace et ajoutez 5,5 ml de solution froide de saccharose à 50 % au fond de chaque tube (voir Tableau 1 pour les solutions de saccharose). Ajouter délicatement la solution de saccharose à 15 % goutte à goutte, en restant près de l’interphase afin de préserver une interphase nette jusqu’à ce que le tube soit complètement rempli. Lorsque le tube est complètement rempli, fermez-le avec un bouchon en caoutchouc pour éviter la formation de bulles d’air.
   3. Dans une chambre froide, posez doucement les tubes horizontalement et maintenez-les dans cette position pendant 2 heures. Après ce temps, redressez lentement les tubes en position verticale et mettez-les sur de la glace. Les dégradés sont maintenant prêts à être utilisés. Vous pouvez également préparer le gradient de 15 à 50 % de saccharose à l’aide d’un formeur de gradient conventionnel.
   4. Dans une chambre froide, prélever délicatement 1,0 ml du haut du gradient et recouvrir goutte à goutte le saccharose avec le lysat cytosolique (c’est-à-dire le surnageant obtenu à l’étape 1.2).
   5. Abaissez soigneusement les tubes dans les godets du rotor à godets oscillants. Centrifuger les gradients pendant 100 min à 180 000 x g à 4 °C à l’aide d’une ultracentrifugeuse.
   6. Après la centrifugation, laissez les tubes dans leurs godets pendant 20 min à 4 °C pour stabiliser les gradients.
3. Fractionnement par gradient de saccharose (2 h)
   1. Retirez soigneusement un tube d’ultracentrifugeuse du rotor de l’ultracentrifugeuse et montez-le sur le dispositif collecteur d’un système de fractionnement par gradient de densité. Prélever des fractions de 1 ml pour surveiller l’absorbance à 260 nm à l’aide d’un détecteur UV/VIS (Voir Figure 1 panneau supérieur). Conservez les fractions collectées sur de la glace.
   2. Préparez des aliquotes de 30-40 μl des fractions d’intérêt. Conservez-les sur de la glace avant de les conserver à -80 °C jusqu’à utilisation. N’utilisez pas d’aliquotes ou de fractions de saccharose qui ont subi plus de deux cycles de congélation-décongélation (voir Figure 1 panneau inférieur).

2. Préparation des échantillons pour la microscopie à force atomique (3 h)

1. À l’aide de ruban adhésif, décollez les feuilles de mica.
2. Lavez les feuilles de mica 3-4 fois avec de l’eau DEPC et placez-les dans une petite boîte de Pétri. Séchez ensuite la surface à l’air.
3. Couvrir le mica avec 200 μl de NiSO₄ et incuber pendant 3 min à RT.{{}}
4. Retirez la solution de nickel puis séchez la surface à l’air. Effectuez toutes les étapes suivantes à 4 °C en plaçant la boîte de Pétri avec le mica sur de la glace.
5. Décongeler une aliquote obtenue en 1.4.2 sur de la glace et ajouter délicatement tout l’échantillon goutte à goutte au mica. À l’aide d’une pointe de 100-200 μl, étalez l’échantillon sur toute la surface du mica. Incuber l’échantillon sur de la glace pendant 3 min.
6. Couvrir la feuille de mica goutte à goutte avec 200 μl de tampon AFM froid (voir Table 1) et incuber pendant 1 heure sur la glace.
7. Imagerie en liquide
   1. Retirez soigneusement le microscope à force atomique tampon (AFM) et lavez les feuilles de mica 3 à 4 fois avec 200 μl de tampon AFM froid pour éliminer l’excès de saccharose. Ensuite, lavez les feuilles de mica 3 fois avec une solution de lavage froide (voir Tableau 1), en laissant la surface du mica recouverte de quelques microlitres de solution.
   2. Passez au point 3 (Acquisition d’images).
8. Imagerie dans l’air
   1. Retirez soigneusement le Buffer-AFM et lavez le mica 3-4 fois avec 200 μl de Buffer-AFM froid pour éliminer l’excès de saccharose. Ensuite, lavez le mica 3 fois avec une solution de lavage froide (voir Tableau 1) et égouttez l’excès d’eau avec du papier.
   2. Laissez sécher l’échantillon sous le capot chimique avec le haut de la boîte de Pétri partiellement ouvert. Au bout de 2 heures, fermez la boîte de Pétri et conservez-la à température ambiante (RT). Mesurez l’échantillon après 2-3 heures, car ils sont stables pendant des années.

3. Acquisition d’images (15 min par image après stabilisation thermique)

Remarque : Les polysomes immobilisés sur mica peuvent être imagés dans l’air ou dans un liquide en utilisant le mode AC.

1. Fixez le mica au porte-échantillon à l’aide de ruban adhésif double face.
2. Insérez le porte-échantillon dans l’étage AFM en suivant les instructions du fabricant. Lors de l’imagerie dans un liquide, essayez si possible de maintenir l’échantillon à une température inférieure à 25 °C pour augmenter la stabilité des polysomes dans le temps.
3. Sélectionnez un porte-à-faux adapté à l’imagerie AC et montez-le sur le porte-embout en suivant les instructions du fabricant. Ici, utilisez des porte-à-faux avec une constante de force comprise entre 2 et 20 N/m pour l’imagerie de l’air et environ 0,1 N/m pour l’imagerie liquide.
4. Ajustez le point laser sur le porte-à-faux et mettez à zéro les signaux du détecteur de quadrant.
5. Sélectionnez une fréquence d’entraînement opportune et entraînez le cantilever avec une amplitude de 10 à 20 nm.
6. Approchez-vous de l’échantillon jusqu’à ce que la pointe s’engage dans la surface.
7. Sélectionnez une zone de balayage de 2 x 2 μm, acquérez des images d’au moins 512 x 512 pixels (largeur de pixel < 4 nm), sélectionnez un mode de soustraction d’arrière-plan en direct et une échelle Z de 20-25 nm.
8. Inspectez l’image à la recherche de la présence d’objets ronds caractérisés par une hauteur comprise entre 10 et 15 nm lors de l’acquisition dans l’air et 25 et 30 nm lorsqu’il est dans un liquide, et une largeur comprise entre 25 et 30 nm. Ajustez les paramètres de consigne et de retour jusqu’à ce que les objets pointus soient visualisés. L’arrière-plan doit apparaître relativement plat dans les bons échantillons, avec quelques objets de hauteur de 2 à 4 nm (voir Figure 2A et B).
9. Si l’image est bonne (comme indiqué au point 3.8), effectuez plusieurs (au moins dix) balayages de 2x2 microns sur différentes zones d’échantillonnage.
10. (facultatif). Si nécessaire, acquérez des images haute résolution des polysomes sélectionnés (voir Figure 2C).
11. Appliquez des corrections logicielles (algorithmes de soustraction de plan et de correction ligne par ligne) pour corriger les images AFM, en supprimant les effets arbitraires d’inclinaison et de dérive.

4. Analyse des données (30 min par image)

1. Exportez les images dans ImageJ (facultatif : appliquer un facteur d’échelle) en utilisant de préférence un format de compression sans perte, par exemple le format TIFF (voir Figure 3A).
2. Utilisez l’ensemble d’outils de macro ImageJ RiboPick.ijm (à copier dans le sous-répertoire macro/toolset d’ImageJ) pour compter les ribosomes dans les polysomes (voir Figure 3B) et calculer les propriétés statistiques de l’échantillon (voir Figure 3C).
   1. Lancez le chargement d’une image à l’aide de l’outil qui initialise le programme.
   2. Choisissez les centres des ribosomes à l’aide de l’outil standard ImageJ (décalage + clic gauche permet la multi-sélection des ribosomes). Marquez les ribosomes sélectionnés à l’aide de l’outil < Marquer les ribosomes >. Les coordonnées des ribosomes apparaîtront dans une fenêtre de texte personnalisée.
   3. Ajouter d’autres ribosomes au même polysome, en répétant la procédure indiquée au point 4.2.2.
   4. Supprimez les ribosomes mal marqués à l’aide de l’outil (commencez à retirer du dernier ribosome ajouté au premier - dans le polysome actuel uniquement).
   5. Une fois le polysome terminé, utilisez l’outil . Au fur et à mesure que le numéro du polysome est ajouté en superposition à l’image, la fenêtre de texte est mise à jour.
   6. Utilisez l’option pour écrire le fichier de coordonnées du ribosome (les unités par défaut de l’image sont utilisées) et une image PNG qui résume les ribosomes et polysomes sélectionnés. L’image d’origine est fermée sans être enregistrée.

Tableau 1. Tampons.

10 mM Tris–HCl, pH 7.5

Tampon	Composition{TAG_526}}	} Application
{{}}Tampon de lyse{TAG_546}}	Préparation du lysat (1.1){{TAG_561 TAG_562}}{{}}
	10 mM NaCl	{{TAG_ 577}}
	{TAG_585}}10 mM MgCl2{TAG_591}}
	1 % Triton-X100
	1 % Na-désoxycholate
	{TAG_629}}0.0.4 U/ml Inhibiteur de la RNase {TAG_635}}
{{ TAG_641}}	1 mM DTT {TAG_649}}
	0.0.2 mg/ml de cycloheximide
	}{{ TAG_673}}5 U/ml Dnase I
50 % solution de saccharose{TAG_687 - }}	50 % (p/v) de saccharose dans	Saccharose préparation du dégradé (1.2)
100 mM NaCl{TAG_716}}{{TAG_717 }}
	{TAG_726}}10 mM MgCl2{{ TAG_733}}
	10 mM Tris/HCl pH 7.5 {TAG_748}}
15 % solution de saccharose{TAG_760}}	{{ TAG_764}}15 % (p/v) de saccharose dans	Préparation du gradient de saccharose (1.2)
100 mM NaCl{TAG_788}}
10 mM MgCl2{TAG_806}}
	{TAG_815}}10 mM Tris/HCl pH 7.5
Nickel Solution	1 mM NiSO4	{TAG_850}}{}} (2)
Buffer-AFM	{TAG_868}}100 mM NaCl	{TAG_875}}} Préparation d’échantillons pour AFM (2) {TAG_881}}
	10 mM MgCl2 {TAG_897}}{TAG_898}}
	100 μg/ml cycloheximide{{}}{}}{}}{{}}100 μg/ml cycloheximide
	10 mM Hepes{{ TAG_924}}
	3 % (p/v) saccharose{TAG_938}} pH = 7.4
Solution	{TAG_960}}DEPC-Water	Préparation d’échantillons pour AFM (2)
100 μg/ml cycloheximide {{ TAG_985}}

{{ TAG_548}}} {TAG_608}} {{ TAG_610}}{TAG_664}} {TAG_678}} {TAG_708}} {TAG_780}} {{ TAG_794}} {{ TAG_824}}{TAG_976}}

Results

Materials