Imagerie à double fluorescence pour identifier les oligodendrocytes différenciés

Résumé

Source : Schott, J. T., et al. Préparation de cultures de progéniteurs d’oligodendrocytes chez le rat et quantification de l’oligodendrogenèse à l’aide d’un balayage par fluorescence infrarouge double. J. Vis. exp. (2016).

Cette vidéo montre l’utilisation de l’imagerie à double fluorescence pour évaluer la différenciation des oligodendrocytes à partir de cellules précurseurs (OPC) isolées du cerveau d’un rat. Le processus comprend la fixation des cellules, le marquage de marqueurs spécifiques avec des anticorps primaires et secondaires conjugués aux fluorophores, et leur visualisation à l’aide de l’imagerie par fluorescence. Des oligodendrocytes différenciés exprimant à la fois la protéine basique de la myéline (MBP) et le facteur de transcription des oligodendrocytes 2 (Olig2) sont identifiés, ce qui les distingue des cellules précurseurs indifférenciées qui n’expriment que Olig2.

Protocole

1. Préparation des plaques de dosage, des solutions mères et des supports de base OPC

Note : Le milieu de base OPC (Sato) du rat décrit ici est dérivé d’études publiées précédemment. Des formulations de milieux alternatifs peuvent également être compatibles avec cette procédure.

1. Resuspend poly-L-lysine (PLL) à une concentration de 10 μg/ml dans de l’eau désionisée stérile. Pipeter 400 μl de la PLL diluée dans chaque puits d’une boîte de culture tissulaire à paroi noire et à fond transparent à 24 puits.
2. Enrobez les boîtes de culture tissulaire pendant 2 heures dans un incubateur de culture tissulaire à 37 °C ou toute la nuit dans un réfrigérateur à 4 °C.
3. Aspirez la PLL des plats enrobés au moins 20 minutes avant le dressage. Laissez sécher la capsule restante du puits en plaçant des plaques de 24 puits avec le couvercle partiellement entrouvert dans une hotte de culture de tissus. Vérifiez que les puits sont complètement secs avant de plaquer les OPC isolés. Les cellules n’adhéreront pas au plastique sur lequel il y a du liquide PLL présent.
4. Prepare N-Acetyl-L-cysteine (NAC) solution mère (1,000x) : Dissoudre 100 mg N-Acetyl-L-cystéine (NAC) dans 20 ml de médium modifié Eagle’s medium (DMEM) de Dulbecco. Aliquote et conserver à -20 °C.
5. Préparez une solution mère d’hydrocortisone (1 000x) : Ajoutez 1 ml d’éthanol à 1 mg d’hydrocortisone et remuez pour dissoudre. Ajouter 19 ml de DMEM, mélanger la solution, aliquote et conserver à -20 °C. Il a été démontré que l’ajout d’hydrocortisone au milieu de base améliore la survie des cellules gliales.
6. Préparez une solution mère de d-biotine (5 000x) : Dissoudre 2,5 mg de d-biotine dans 50 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Ajouter 1 à 2 gouttes de 5 μl de NaOH 0,1 N pour faciliter la dissolution. Aliquote et conserver à -20 °C.
7. Préparez la solution mère d’insuline (100x) : Dissoudre 25 mg d’insuline dans 50 ml d’eau de qualité culture tissulaire. Ajouter 250 μl de HCl 1 N et mélanger jusqu’à ce que la solution soit claire. Stériliser avec un filtre de 0,22 μm et conserver à 4 °C jusqu’à 6 semaines.
8. Préparer la solution mère Sato (100x) :
   1. Préparer la solution mère de progestérone (25 μg/μl) : Dissoudre 2,5 mg de progestérone dans 100 μl d’éthanol.
   2. Préparez une solution mère de sélénite de sodium (400 ng/μl) : Dissoudre 4 mg de sélénite de sodium dans 100 μl de 0,1 N NaOH. Ajouter 10 ml de DMEM et mélanger.
   3. À 100 ml de DMEM, ajoutez 1 g d’apo-transferrine humaine, 1 g d’albumine sérique bovine et 160 mg de putrescine et mélangez pour dissoudre complètement. Ajouter 25 μl de solution mère de progestérone, 1 000 μl de solution mère de sélénite de sodium et mélanger. Aliquote et conserver à -20 °C.
9. Préparez le milieu de base OPC : pour 100 ml de DMEM (avec 4,5 g/L de D-glucose, de L-glutamine et 110 mg/L de pyruvate de sodium), ajoutez 100 μl de NAC, 100 μl d’hydrocortisone, 20 μl de d-biotine, 1 ml d’insuline, 1 ml de bouillon Sato, 100 μl d’oligo-éléments B, 2 ml de supplément B-27 (50x) et 1 ml de pénicilline/streptomycine (100x). Stériliser avec un filtre de 0,22 μm et conserver à 4 °C.
10. Préparez une solution mère de facteur de croissance dérivé des plaquettes AA (PDGF-AA) (1 000x) : Dissoudre 250 μg dans 12,5 ml de PBS avec 0,1 % d’albumine sérique bovine (BSA) pour obtenir une solution à 20 μg/ml. Aliquote et conserver à -80 °C.
11. Préparer le milieu de prolifération OPC : milieu de base OPC complété par 20 ng/ml de PDGF-AA.
12. Préparer le milieu de différenciation OPC : milieu de base OPC complété par 45 nM de triiodothyronine.
13. Préparez le tampon de colonne : À 500 ml de PBS, ajoutez 2,5 g de BSA et 2 ml d’acide éthylènediaminetétraacétique 0,5 M (EDTA) et ajustez le pH à 7,2. Stériliser avec un filtre de 0,22 μm et conserver à 4 °C.

2. induction de la différenciation et de la fixation OPC avec 4 % de paraformaldéhyde

Note : Lors de tests sur l’effet de petites molécules sur l’oligodendrogenèse, nous dissolvons régulièrement des médicaments dans du diméthylsulfoxyde (DMSO) pour préparer des stocks 1 000 fois plus nombreux qui peuvent ensuite être stockés à -80 °C et dilués directement dans le milieu SATO pour obtenir une concentration finale de 0,1 % de DMSO. Nous n’avons observé aucun changement dans la prolifération ou la différenciation des OPC en utilisant cette concentration de DMSO (données non présentées).

1. Préchauffez le support de base OPC à 37 °C et décongelez les supports de traitement médicamenteux à température ambiante. Lors de l’exécution de traitements en double, préparer environ 1,25 ml de milieu par groupe de traitement dans un tube de 1,5 ml. Pour les échantillons en trois exemplaires, utilisez des tubes à centrifuger d’une capacité de 2 ml pour tenir compte du mou.
2. Préparez les mélanges maîtres de traitement pour les puits répliqués en diluant les stocks de traitement directement dans le milieu de base OPC. Agitez brièvement ou mélangez délicatement chaque mastermix pour assurer une répartition homogène du traitement.
3. Préparez 45 nM triiodothyronine (T₃) en tant que commande positive et le véhicule approprié en tant que commande négative. Dilute 10 mM T₃ stocker 1:1 000 dans 1 ml de milieu de base OPC, puis diluer davantage dans le mélange maître de traitement pour réduire la concentration finale de DMSO si nécessaire.
4. Aspirez le milieu des puits de culture un groupe de traitement à la fois afin d’éviter de dessécher les cellules. Utilisez une pointe de pipette de 200 μl à l’extrémité de la pipette Pasteur en verre pour éviter de gratter la matière noire sur les côtés du puits et dans la culture.
5. Ajouter lentement 500 μl de mastermix de traitement le long du côté du puits à l’aide d’une pipette de 1 ml.
6. Incuber les cultures pendant la période souhaitée, en effectuant un échange complet de milieu avec des milieux de traitement frais tous les 2-3 jours. Nous observons régulièrement un MBP style='font-family :Arial,sans-serif ;font-size :0.6em ;font-style :normal ;font-variant :normal ;font-weight :400 ;text-decoration :none ;vertical-align :baseline ;white-space :pre-wrap ;'>⁺ culture après 4 jours en Milieux de différenciation.
7. À la fin de la période de traitement souhaitée, préparez du paraformaldéhyde (PFA) frais à 4 % ou décongelez un bouillon congelé à température ambiante. ATTENTION :<span style='font-family :Arial,sans-serif ; taille de police :12pt ; font-style :normal ; font-variant :normal ; poids de la police :400 ; texte-décoration :aucun ; vertical-align :ligne de base ; espace-blanc :pré-enveloppement ;' > PFA est extrêmement toxique et doit être préparé dans une hotte.
8. Aspirez le média et ajoutez lentement 400 μl de PFA sur le côté du puits pour fixer les cellules. Incuber la plaque pendant 20 min à température ambiante.
9. Aspirez le PFA et ajoutez lentement 500 μl de solution saline tamponnée au phosphate stérile de Dulbecco (D-PBS, avec Ca²⁺ et Mg²⁺) sur le côté du puits pour laver les cellules. Répétez le lavage deux fois au total. Ne pas aspirer le lavage final.
10. Enveloppez la plaque dans du parafilm et conservez-la à 4 °C pour un traitement ultérieur ou passez directement à l’étape suivante. Les plaques peuvent être conservées pendant plusieurs semaines.

3. Immunocytochimie et quantification de la protéine basique de myéline

Note : Lors de la manipulation de liquides sur les plaques à 24 puits, il est recommandé de travailler rapidement pour éviter de dessécher les cellules. Ici, l’utilisation d’un aspirateur multicanaux et d’une pipette multicanaux est recommandée.

1. Amenez la plaque à température ambiante, aspirez les puits et ajoutez 250 μl de D-PBS (avec Ca²⁺ and Mg²⁺) contenant 0,1 % de Triton X-100 et 5 % de sérum de chèvre normal (NGS). Incuber la plaque à température ambiante pendant 1 heure en secouant doucement l’orbite.
2. Préparez la solution d’incubation primaire en diluant l’anticorps monoclonal anti-MBP de souris 1:1 000 et l’anticorps polyclonal anti-actine de lapin 1:200 dans du D-PBS (avec Ca²⁺ et Mg²⁺) contenant 5 % NGS. Alternativement, l’anti-Olig2 polyclonal de lapin à 1:1 000 peut être utilisé pour la normalisation spécifique des oligodendrocytes dans les cultures gliales mixtes. Préparez suffisamment de solution primaire pour contenir 250 μl par puits.
3. Incuber les anticorps primaires à 4 °C pendant la nuit pendant 16 à 18 heures en secouant doucement les orbites.
4. Aspirez la solution d’incubation primaire et lavez les cellules 3 x 10 min avec 500 μl de D-PBS (avec Ca²⁺ et Mg²⁺) à température ambiante avec une légère agitation orbitale.
5. Pendant le lavage de la plaque, préparez la solution d’incubation secondaire en diluant les anticorps anti-souris 680 et anti-lapin 800 1:500 dans du D-PBS (avec Ca²⁺ et Mg²⁺) contenant 5 % NGS. Minimisez l’exposition à la lumière ambiante lors de la préparation de cette solution.
6. Aspirez le lavage final et ajoutez 250 μl de solution d’incubation secondaire. Protégez la plaque de la lumière et incubez-la à température ambiante pendant 1 heure en secouant doucement l’orbite.
7. Aspirez la solution d’incubation secondaire et lavez les puits 3 x 10 min avec 500 μl de D-PBS (avec Ca²⁺ et Mg²⁺) à température ambiante avec une légère agitation orbitale.
8. Scannez la plaque à l’aide d’un système d’imagerie capable de détecter les émissions de fluorescence de 700 nm et 800 nm. Comme point de départ, réglez le décalage focal sur 3 et les sensibilités sur 1,5 pour MBP, 5,0 pour Actin et 3,5 pour Olig2. Ajustez les valeurs de sensibilité si nécessaire pour éviter une surexposition du signal.
9. Quantifier l’étendue de l’oligodendrogenèse à l’aide de méthodes logicielles semi-automatisées.
   1. À l’aide du logiciel, réglez le mode d’analyse des plaques sur « 24 puits » et alignez les cercles autour du périmètre extérieur des puits numérisés. Réglez le canal de normalisation sur « 800 » et exportez les intensités de fluorescence totale et relative pour les canaux 700 nm (MBP) et 800 nm (Olig2/Actin).
   2. Divisez l’intensité à 700 nm par l’intensité à 800 nm pour obtenir l’expression normalisée de MBP en unités de fluorescence relatives. Calculez la moyenne des mesures répétées et adaptez l’expression aux contrôles Jour 0 + PDGF si nécessaire pour l’analyse.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Matériaux de culture
PDGF-AA	PeproTech Inc	100-13A	20 ng/mL
Dimethyl sulfoxyde	Sigma-Aldrich	D2650	Hybri-Max 100 mL
Triiodothyronine	Sigma-Aldrich	T6397	45 nM
Fumarate de clémastine salt	Sigma-Aldrich	SML0445-100MG	1 μM
Sel d’hémifumarate de quétiapine	Sigma-Aldrich	Q3638-10MG	1 μM
N-acétyl cystéine	Sigma-Aldrich	A9165	5 μg/mL
Progestérone	Sigma-Aldrich	P8783	60 ng/mL
Poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	P1524	10 μg/mL
Putrecine	Sigma-Aldrich	P7505	16 μg/mL
Sélénite de sodium	Sigma-Aldrich	S5261	40 ng/mL
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H0135	50 ng/mL
d-Biotin	Sigma-Aldrich	B4639	10 ng/mL
Insulin	Sigma-Aldrich	I6634	5 μg/mL
Apo-Transferrin	Sigma-Aldrich	T1147	100 μg/mL
Albumine de sérum bovin	Sigma-Aldrich	A4161	100 μg/mL
Trace Elements B	Corning	25-022-Cl	1 x
B-27 Supplément	Life Technologies	17504044	1 x
Pénicilline/Streptomycine	Life Technologies	15140122	1 x
DMEM	Life Technologies	11995-065	1 x
24-puits Visiplate noir avec couvercle	Perkin Elmer	1450-605	Grade de culture tissulaire
	<
Immunocytochimie et quantification<
PFA	Sigma-Aldrich	100-13A	4 %
Sigma-Aldrich	78787	0.10 %
Sérum de chèvre normal	Jackson Immuno Research	005-000-121	5 %
souris monoclonale anti-MBP	Biolegend	SMI-99P	1:1000 Dilution
lapin polyclonal anti-actine	Santa Cruz Biotecnology	SC-7210	1:200 Dilution
rabbit polyclonal anti-Olig2	Millipore	AB9610	1:1000 Dilution
goat anti-souris 680RD	Licor	926-68070	1:500 Dilution
chèvre anti-lapin 800CW	Licor	926-32211	1:500 Dilution
Alexa Fluor 594 chèvre anti-souris	Life Technologies	A11032	1:000 dilution
Alexa Fluor 488 chèvre anti-lapin	Life Technologies	A11008	dilution 1:000
Prolong Gold antifade with DAPI	Life Technologies	P36931
DPBS with Ca2+ et Mg2+	Corning	21-030-CV
Licor Odyssey Clx Infared Imaging System	Licor

< style='débordement :caché ;rembourrage :0px 3px ;alignementvertical :bas ;'> td style='débordement :caché ;rembourrage :0px 3px ;align-vertical :bas ;'> tr style='hauteur :21px ;'>< style='débordement :caché ;rembourrage :0px 3px ;alignementvertical :bas ;'>Triton X-100