Visualisation des mitochondries dans les fibres nerveuses intraépidermiques

Résumé

Source : Hamid, H. S., et al. Imagerie et analyse tridimensionnelles des mitochondries dans les fibres nerveuses intraépidermiques humaines. J. Vis. exp. (2017)

Cette vidéo montre la méthode de visualisation des mitochondries spécifiques aux nerfs à l’aide de l’imagerie tridimensionnelle. Il décrit le processus d’acquisition de scans séquentiels de fibres nerveuses intraépidermiques pré-marquées et de génération d’images de surface 3D pour isoler et afficher les mitochondries en relation avec les structures nerveuses.

Protocole

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p style='line-height :1.2 ;margin-bottom :0pt ;margin-top :0pt ;' dir='ltr'>Toutes les procédures impliquant la collecte d’échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l’IRB de l’institut.

1. Imagerie Confocale

1. Effectuer une imagerie confocale :
   1. Collectez des images à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser avec un objectif à immersion dans l’huile 40X (ouverture numérique de 1,25 (N.A.)) sur un microscope inversé.
      1. À chaque plan focal, acquérez séquentiellement des signaux fluorescents :
         Noyaux : excitation λ = 405 nm, filtre d’émission spectrale λ = 420 - 480 nm
         Fibres nerveuses : excitation λ= 488 nm, filtre d’émission spectrale λ = 505 - 560 nm
         Mitochondries : excitation λ = 543 nm, filtre d’émission spectrale λ= 606 - 670 nm
   2. Entrez les paramètres de balayage suivants dans le logiciel du microscope : vitesse de balayage de 600 Hz avec moyenne de 2 images et zoom de 2,2 ; Résolution d’intensité 12 bits (4096 niveaux de gris).
      1. Réglez le logiciel du microscope pour une résolution latérale optimisée (résolution de balayage = 1 024 x 1 024) et une résolution axiale/sectionnement optique (ouverture confocale = 1 unité d’air (AU) avec une taille de pas z de 210 nm).
         REMARQUE : La résolution XYZ résultante est de 172.2 nm x 172.2 nm x 210 nm avec une taille d’image de 176.1 μm x 176.1 μm x 30-50 μm.
   3. Activez un balayage en direct du signal nerveux (fluorescence verte) et ajustez la commande z-focus pour trouver et régler les plans focaux supérieur et inférieur dans le logiciel du microscope qui englobent le signal nerveux dans la section du tissu. La plage z totale est généralement de 30 à 50 μm pour une coupe de tissu de 50 μm.
   4. Faites pivoter le champ de balayage avec le logiciel du microscope pendant un balayage en direct afin que l’épiderme soit positionné horizontalement ou verticalement dans l’image.
   5. Scannez chaque signal séparément et ajustez la tension et le décalage du détecteur (tube photomultiplicateur, PMT) pour minimiser/supprimer les pixels sursaturés et sous-saturés.
      REMARQUE : Les temps de balayage avec les paramètres ci-dessus prennent environ 20 à 40 min, selon le nombre de z-slices.

2. 3D Visualisation et analyse des mitochondries dans les fibres nerveuses intraépidermiques humaines

1. Isole l’épiderme 3D :
   1. Dupliquez l’image originale et utilisez la projection d’intensité maximale (vue à focale étendue) de l’image pour identifier et isoler l’épiderme.
   2. Utilisez un outil de région d’intérêt pour tracer le long des bords supérieur et inférieur de l’épiderme afin d’éliminer les zones indésirables, telles que la couche cornée et le derme, qui sont absentes des fibres nerveuses intra-épidermiques. Recadrez pour cette sélection.
2. Utiliser la déconvolution sur le nerf et les signaux fluorescents mitochondriaux :
   REMARQUE : déconvolution aide à restaurer l’intégrité des signaux fluorescents. La restauration utilisée dans ce protocole est appelée déconvolution aveugle car elle utilise les signaux fluorescents dans les images pour déterminer dans quelle mesure les signaux se propagent à partir de leur source d’origine (fonction d’étalement de points). Le processus améliore la résolution du signal en réaffectant la propagation du signal à son emplacement d’origine.
   1. Calcule une fonction d’étalement de points (PSF) pour le signal nerveux fluorescent vert (green-fluorescence) avec les paramètres suivants :
      1. Réglez la PSF calculée sur confocale. Réglez l’indice de réfraction moyen sur 1,515 et l’ouverture numérique sur 1,25. Réglez le sténopé du détecteur sur 1 UA. Réglez la longueur d’onde d’excitation laser sur 488 nm et la longueur d’onde d’émission sur 515 nm.
   2. Calculez une PSF pour le signal mitochondrial fluorescent rouge (fluorescence rouge) avec les paramètres suivants :
      1. Définit le PSF calculé sur confocal. Réglez l’indice de réfraction moyen sur 1,515 et l’ouverture numérique sur 1,25. Réglez le sténopé du détecteur sur 1 UA. Réglez la longueur d’onde d’excitation laser sur 543 nm et la longueur d’onde d’émission sur 617 nm.
   3. Optimisez les signaux fluorescents des nerfs et des mitochondries par déconvolution à l’aide des PSF correspondants énumérés ci-dessus et de la fonction de restauration itérative définie avec un niveau de confiance de 100 % et une limite d’itération de 10 cycles.
3. Créez des surfaces spécifiques aux nerfs :
   1. Utilisez l’outil « create surface » pour créer une surface solide des nerfs à partir du marquage secondaire vert-fluorescent déconvolué des nerfs identifiés par le produit génique protéique 9.5 (PGP9.5).
   2. Décochez la fonction « lisse » et utilisez la fonction d’intensité absolue pour définir le seuil du signal nerveux, car il est nettement plus lumineux que la fluorescence de fond.
   3. Utilisez la fonction d’intensité absolue pour définir le seuil du signal nerveux, car il est nettement plus brillant que la fluorescence de fond. Réglez la valeur seuil suffisamment basse pour identifier avec précision les nerfs.
   4. Filtrez les petites surfaces non nerveuses en fonction de la taille.
      REMARQUE : Si nécessaire, modifiez manuellement les surfaces non nerveuses supplémentaires dans l’onglet « Modifier » en maintenant la touche CONTROL enfoncée pour mettre en évidence plusieurs objets, puis en les supprimant avec la touche Suppr.
4. Isolez le signal mitochondrial fluorescent spécifique du nerf :
   1. Sélectionnez l’onglet Modifier de la surface nerveuse pour afficher la fonction « Propriétés du masque ». La surface nerveuse créée est utilisée pour isoler les mitochondries à l’intérieur de ces nerfs, loin des signaux mitochondriaux associés aux kératinocytes.
   2. Lorsque le bouton « Masquer tout » ouvre une fenêtre « Masquer le canal », choisissez le signal rouge-fluorescent déconvoluté dans le menu déroulant sous « Sélection de canal » pour le signal mitochondrial.
   3. Cliquez dans la case pour cocher l’option « Dupliquer le canal avant d’appliquer le masque ».
   4. Cliquez sur le bouton radio devant l’option « Constante intérieur/extérieur » des paramètres du masque et cliquez dans la case pour cocher l’option « Définir le voxel surface extérieure sur » et tapez 0,00 pour la valeur. Cliquez sur le bouton OK pour créer le nouveau canal qui représente les signaux mitochondriaux à la surface nerveuse.
5. Créer des surfaces spécifiques aux mitochondries :
   1. Utilisez l’outil « create surface » pour créer une surface solide des mitochondries à partir du canal fluorescent nouvellement créé des signaux mitochondriaux spécifiques aux nerfs.
   2. Décochez la fonction « lisse » et sélectionnez la fonction « soustraction d’arrière-plan » pour définir le seuil. Cette caractéristique utilise le contraste local autour du signal mitochondrial pour identifier les mitochondries de l’arrière-plan.
   3. Réglez la valeur seuil suffisamment basse pour identifier les mitochondries avec précision. Dans cet exemple, le seuil inférieur a été fixé à 2 000 pour une échelle de 16 bits (65 536).
   4. Filtrez les surfaces mitochondriales en fonction de leur taille. Dans cet exemple, la limite de voxels a été définie sur 1,0 voxels, ce qui est la limite la plus basse possible. Si nécessaire, modifiez manuellement les surfaces non mitochondriales dans l’onglet « Modifier » en maintenant la touche CONTROL enfoncée pour sélectionner plusieurs objets, puis en les supprimant avec la touche Suppr.
      NOTE : Parfois, le logiciel crée des surfaces qui ne sont pas associées à un signal mitochondrial fluorescent distinct. Dans ces cas, il est possible de les supprimer avec l’onglet « Modifier ».

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Microscope confocal à balayage laser Leica SP5	Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL	SP5
Logiciel Volocity x64	Perkin Elmer, Waltham , MA	Version 4.4.0	Le logiciel Volocity est utilisé pour le traitement d’images
Imaris x64 logiciel d’analyse 3D{{TAG_ 31}}	Bitplane, Concord, MA	Version 7.7.1	Le logiciel Imaris est utilisé pour l’analyse d’images