Imagerie calcique ex vivo pour étudier les réponses cérébrales de la drosophile aux neuropeptides

Résumé

Source : Ishimoto, H. et al., imagerie calcique ex vivo pour visualiser les réponses cérébrales à la signalisation endocrinienne chez la drosophile. J. Vis. Exp. (2018)

Cette vidéo démontre l’imagerie calcique à étudier Drosophila réponses cérébrales aux neuropeptides. Les neurones exprimant un indicateur de calcium fluorescent révèlent la dynamique du calcium intracellulaire et les réponses fonctionnelles aux molécules de signalisation.

Protocole

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p style='background-color :#ffffff ;line-height :1.380000000000001 ;margin-bottom :12pt ;margin-top :0pt ;text-align :justify ;' dir='ltr'>1. Préparation des explants de cerveau larvaire

1. Fabrique une chambre d’imagerie.
   NOTE : Un enregistrement stable nécessite que les explants cérébraux soient attachés. Ici, une chambre d’imagerie peu coûteuse, fabriquée à la main, est utilisée dans le style Ca²⁺ système d’imagerie.
   1. À l’aide d’une pince, grattez le centre inférieur d’une boîte de culture en plastique (35 mm x 10 mm) pour créer une entaille pour le ganglion ventral du cerveau larvaire, facilitant ainsi le montage (étape 1.3, Figure 1).
   2. À l’aide d’un cure-dent, placez une petite goutte de superglue de chaque côté de la bosse et fixez une tige de tungstène (0,125 mm de diamètre, 6 à 7 mm de longueur) à la colle.
   3. À l’aide d’un petit morceau d’adhésif réutilisable semblable à du mastic, faites une paroi circulaire (10 mm de diamètre et 3 mm de haut) entourant la bosse (Figure 1).
      NOTE : L’espace à l’intérieur du mur sera ensuite rempli d’une solution saline tamponnée au phosphate (PBS ; 0,14 M de chlorure de sodium (NaCl), 0,0027 M de chlorure de potassium (KCl), 0,01 M d’ions phosphate (PO4^3–), pH 7.4 ± 0.05 à 25 °C).
2. Animal preparation
   NOTE : Pour l’imagerie calcique, un indicateur calcique, GCaMP6s, est exprimé dans le type de cellule d’intérêt, ce qui est généralement réalisé en utilisant des combinaisons de GAL4 spécifiques au tissu et de UAS-GCaMP6s. Pour s’assurer que le signal est médié par le récepteur candidat, GCaMP6s est également exprimé dans un mutant défectueux dans le récepteur.
   1. Lorsque des comparaisons expérimentales pour différents génotypes tels que le type sauvage et les mutants sont nécessaires, testez les larves pour éviter les variations de niveau d’expression de GCaMP6 et les différences physiologiques dues aux stades de développement.
   2. Conservez les mouches parentales (30 mouches pour chaque sexe) dans un flacon de culture contenant de la nourriture standard pour mouches pendant 8 heures pour permettre la ponte à la surface de la nourriture. Élever les larves en masse sous un cycle lumière-obscurité de 12 heures à 25 °C et à 60-70 % d’humidité relative.

3. Dissection du cerveau larvaire
   1. À 90-120 h après la ponte (AEL), prélever les larves et les laver au moins 3 fois avec de l’eau distillée pour éliminer les débris alimentaires adhérents.
   2. Placez une larve sur un verre de montre carré de 1,5 pouce rempli de PBS glacé.
      NOTE : Les deux étapes suivantes sont effectuées dans ce verre de montre sous le microscope à dissection.
   3. Utilisez une pince pour saisir doucement la partie centrale de la larve. Utilisez une autre pince pour saisir les crochets buccaux et tirez doucement les crochets buccaux pour séparer la partie antérieure de la larve contenant le cerveau du reste du corps.
      NOTE : alternativement, Des ciseaux chirurgicaux peuvent être utilisés.
   4. Tenez l’extrémité antérieure à l’aide d’une pince et retournez la larve. Retirez les tissus étrangers attachés au cerveau, tels que les disques imaginaux, les corps adipeux et les glandes annulaires. Séparez doucement le cerveau des pièces buccales.
   5. Appliquez 200 μL de PBS à l’intérieur de l’anneau fabriqué à partir de l’adhésif réutilisable semblable à du mastic dans la chambre d’imagerie. Aspirez doucement le cerveau disséqué avec du PBS dans une pipette Pasteur, puis transférez-le dans la chambre d’imagerie.

4. Setting the brain into the imaging chamber
   1. Utilisez une pince pour saisir les fibres musculaires qui s’étendent des ganglions ventraux. Insérez doucement le cerveau dans la bosse sous le fil de tungstène.
   2. À l’aide d’une autre pince, tirez légèrement le fil de tungstène vers le haut pour placer le cerveau dans la bonne position pour l’imagerie (Figure 1).

2. Acquisition de Ca²⁺ images de fluorescence

REMARQUE : Les explants de cerveau immergés dans le PBS sont imagés à l’aide d’un microscope à fluorescence équipé d’une lentille d’objectif à immersion dans l’eau 20X (ouverture numérique, N.A. = 0.5). Le PBS n’active pas les cellules du cerveau. Si des images de l’axe Z sont nécessaires, l’objectif est monté à l’aide d’un moteur d’objectif activé par piézoélectrique. Une tête confocale à disque rotatif est utilisée pour améliorer la résolution temporelle. Pour l’imagerie à faible luminosité, une caméra à dispositif couplé à la charge multiplicatrice d’électrons est montée sur le microscope. L’imagerie de la fluorescence GCaMP6s (excitation/émission : 488/509 nm) nécessite un laser de 488 nm pour l’excitation avec un séparateur de faisceau dichroïque et un filtre d’émission (e.g., 528 ± filtre passe-bande 38 nm).

1. Place la chambre d’imagerie contenant l’explant de cerveau sous le microscope.
2. Abaissez l’objectif jusqu’à ce qu’il touche le PBS. Sous un éclairage en fond clair, positionnez le cerveau et faites-le point. Passez à la lumière fluorescente et ajustez la mise au point sur les cellules marquées par GCaMP6s.
   NOTE : Le vert basal la fluorescence des GCaMP6 doit être visible.
3. Démarrez l’acquisition à 250 ms/image à une résolution de 512 × 512 pixels en mode refroidi à l’eau à l’aide du logiciel d’acquisition approprié (e.g., μManager). Ajustez le temps d’exposition pour obtenir des valeurs de fluorescence dans la plage dynamique de la caméra CCD, mais pas inférieures à 1000 (unités arbitraires), avec des images 16 bits (plage dynamique 0-65 535).
   NOTE : Un temps d’exposition faible doit être utilisé pour minimiser le photoblanchiment des GCaMP6. Le temps d’exposition doit être optimisé dans chaque expérience car il dépend des niveaux d’expression de GCaMP6 et de la sensibilité du système de détection. C’était 100 ms dans notre expérience en utilisant dilp2>GCaMP6s. Lorsque des sections z sont nécessaires pour une profondeur d’imagerie donnée, plusieurs images de section z peuvent être acquises en fonction du temps d’exposition et des intervalles d’images. Si l’appareil photo a une résolution spatiale suffisante, la taille du binning (nombre de registres sur la puce qui seront regroupés en un pixel numérique) doit être augmentée pour réduire le temps d’exposition.
4. Une fois les paramètres d’imagerie déterminés, prendre des images pendant 1 min avant l’administration du peptide pour détecter les intensités du signal de base (F₀).
5. Appliquez le peptide d’essai ; pour cela, dissoudre 100 μL de solution peptidique dans du PBS et le pipeter directement dans le bain larvaire pour obtenir une concentration optimale.
   NOTE : Le peptide solution doit être injectée lentement (e.g.<span style='font-family :Arial,sans-serif ; taille de police :12pt ; font-style :normal ; font-variant :normal ; poids de la police :400 ; texte-décoration :aucun ; vertical-align :ligne de base ; espace-blanc :pré-enveloppement ;' >, débit de 20 μL/s) dans la solution du bain à l’aide d’une pipette. Un peptide synthétique non apparenté dissous dans le PBS est utilisé comme témoin négatif.
6. Enregistrez l’émission du GCaMP6 pendant quelques minutes.

Résultats

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tige de tungstène	A-M systems, Sequim, WA, USA	717000
Blu Tack	Bostik, Paris, France	3049100	Adhésifs réutilisables de type mastic
Verre de montre, carré, 1 5/8 po	Carolina Biological Supply Company, Burlington, NC, États-Unis	742300
PBS	TAKARA Bio Inc., Kusatsu, Shiga, Japon	T900	Sels tamponnés phosphatés
CCHa2	SCRUM Inc., Tokyo, Japon		Peptide synthétisé par Custum
Ghrerin	Peptide institute Inc., Osaka, Japon	4372-s
Nociceptin	Peptide institute Inc., Osaka, Japon	4313-v
Axio Imager A2	Carl Zeiss, Oberkochen, Allemagne	Axio Imager A2	Fluorescence microscope
Objectif W N-Achroplan 20x/0.5 M27	Carl Zeiss, Oberkochen, Allemagne	420957-9900-000	lentille d’objectif à immersion dans l’eau
P-725 Scanner d’objectif PIFOC avec longue portée de course	Physik Instrumente GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Allemagne	N/A	Moteur de lentille activé par piézoélectrique
Unité de scanner confocal CSU-W1	Yokogawa Electric Corporation, Tokyo, Japon	CSU-W1	Tête confocale à disque tournant
ImagEM C9100-13	Hamamatsu Photonics, Sizuoka, Japon	C9100-13	Caméra EM-CCD
OBIS 488 nm LS 60 mW	Coherent, Santa Clara, CA, États-Unis	1178770	488-nm laser
488/568/647 nm Yokogawa dichroic beamsplitter	Semrock, Rochester, NY, États-Unis	Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5	Séparateur de faisceau dichroïque
528/38 nm BrightLine single-band bandpass filter	Semrock, Rochester, NY, États-Unis	FF01-528/38-25	Filtre d’émission
μManager	Open Imaging, Inc.	N/A	https://micro-manager.org