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Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.
1. Extraction du cerveau, sectionnement et préparation des tissus
- Sacrifiez la souche de souris de type wild C57BL/6 en l’euthanasiant profondément avec CO2 asphyxie pendant 5 min. Assurer la mort par luxation cervicale.
- Nettoyez la tête de la souris avec de l’éthanol à 70 %.
- Effectuez une craniectomie à l’aide de ciseaux et de pinces stériles en retirant d’abord la peau, en commençant par le haut de la tête pour exposer le crâne.
- Ensuite, lorsque le crâne est exposé, retirez le crâne en épluchant l’os morceau par morceau, en commençant par le côté postérieur et en se déplaçant vers le côté antérieur. Veillez à ne pas détruire les ventricules cérébraux.
- Récupérez tout le cerveau.
- Placez le cerveau dans une boîte de Pétri de 100 mm contenant du milieu d’aigle modifié de Dulbecco (DMEM)/hyperglucose complété par 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) et une solution de pénicilline/streptomycine à 1 % contenant 10 000 unités/ml de pénicilline et 10 000 μg/ml de streptomycine et préchauffée à 37 °C.
- Coupez le cerveau sur le plan sagittal médian à la main avec une lame tranchante, et utilisez un vibratome pour obtenir la première section de 100 à 200 mm de chaque moitié.
- Rincez le tissu cérébral avec une solution saline tamponnée au phosphate préchauffée à 37 °C (1x PBS).
- Placez immédiatement la section du cerveau dans un milieu DMEM/hyperglycémiant préchauffé à 37 °C.
2. Configuration et configuration de l’imagerie en direct
- Placez les coupes de tissu cérébral dans des boîtes de culture à fond de verre de 30 mm contenant 1 ml de milieu DMEM/à haute teneur en glucose. Ajustez l’environnement de la chambre fermée du microscope à 37 °C, 95 %/5 % O2/CO2 content (Figure 1).
- À l’aide d’une lentille d’immersion dans l’huile d’objectif 60X, collectez les images des cellules/cils épendymaires en plaçant une goutte d’huile sur la lentille d’objectif 60X et en faisant la mise au point sur les cellules avec une lumière transmise par contraste interférentiel différentiel (CID) régulière.
- Ensuite, suivez la direction du mouvement de la bulle DMEM comme guide vers l’emplacement des cils épendymaires mobiles, car les battements ciliaires créent une sorte de mouvement de bulle dans la zone. Choisissez une zone contenant des cellules saines avec des cils mobiles dans le ventricule latéral du cerveau à l’aide du filtre CIVD. Une fois les cils épendymaires trouvés, ajustez la lumière et la mise au point pour obtenir une image satisfaisante.
- À l’aide du logiciel d’imagerie Metamorph, définissez les paramètres d’imagerie en direct en fonction d’un objectif spécifique. Dans la présente démonstration, acquérez des images vingt-quatre bits avec le binning de la caméra réglé sur 1 x 1 combiné à un objectif 60X et un temps d’exposition de 5 à 10 ms.
- Collectez les images DIC en ouvrant l’ouverture du microscope à un niveau optimal pour un temps d’exposition minimal. Observez les images en direct diffusées sur l’appareil photo pour fournir une acquisition d’image rapide et immédiate sans délai. Calculez la vitesse de battement des cils en fonction de l’exigence des temps d’exposition minimaux pour obtenir un contraste d’image suffisant.
