Imagerie des mitochondries neuronales à l’aide d’un microscope électronique à balayage à face carrée en série

Résumé

Source : Mukherjee, K., et. al. Analyse des mitochondries cérébrales à l’aide de la microscopie électronique à balayage en série Block-face. J. Vis. Exp. (2016)

Cette vidéo démontre la préparation, l’imagerie et l’analyse du tissu cérébral de souris à l’aide d’un microscope électronique à balayage à face de bloc en série (SBFSEM) pour visualiser l’ultrastructure mitochondriale, permettant une cartographie précise de leur morphologie et de leur distribution spatiale dans les compartiments neuronaux axonaux et dendritiques.

Protocole

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p style='line-height :1.380000000000001 ;margin-bottom :6pt ;margin-top :0pt ;text-align :justify ;' dir='ltr'>Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le Comité d’éthique animale.

1. Préparation du tissu cérébral et de l’imagerie SBFSEM

1. Anesthésie une jeune souris noire C57 (~2 - 4 mois) souris noire (souche C57BL/6J) en utilisant 4 - 5 % d’isoflurane en suivant les directives institutionnelles. Confirmez l’anesthésie en surveillant la perte de tonus musculaire, l’absence de mouvements volontaires et les réponses à des stimuli aversifs comme un pincement de la queue.
2. Placez la souris sur un plateau de dissection et faites une incision sur la peau le long de la ligne médiane ventrale. Faites d’autres incisions dans la peau pour exposer la cage thoracique de la souris. Incisez le diaphragme, disséquez soigneusement la cavité thoracique le long de la périphérie pour exposer le cœur battant, puis faites une incision sur l’oreillette droite.
3. À l’aide d’une canule papillon, canulez le ventricule gauche. Perfuser la souris par voie transcardiale à l’aide de 10 à 20 ml de solution saline tampon phosphatée (PBS) pH 7,2, jusqu’à ce que l’exsanguination soit confirmée par un changement de couleur du foie.
   Note : Un changement de couleur du foie est utilisé comme guide pour déterminer l’étendue de l’exsanguination. Confirmez que la couleur du foie passe du brun rougeâtre au rose pâle.
4. Perfuser la souris par voie transcardiale à l’aide de 10 à 20 ml de glutaraldéhyde à 2 % et de paraformaldéhyde à 4 % fabriqués dans un tampon cacodylate à 0,10 M (pH 7,2), pour fixer rapidement le tissu cérébral de l’intérieur. La fixation est surveillée en observant le raidissement de la queue.
   Note : Préparez un tampon de cacodylate 0,10 M (pH 7,2) en dissolvant 2,14 g de cacodylate de sodium dans 80 ml d’eau, ajoutez de l’acide chlorhydrique pour ajuster le pH et portez le volume à 100 ml avec de l’eau.
5. Après la perfusion, décapiter la souris disséquer le cerveau, puis fixer dans un tampon de cacodylate de sodium de 0,10 M (pH 7,2) contenant 2 % de glutaraldéhyde et 4 % de paraformaldéhyde pendant 48 h à 4 ^oC.
6. Après 48 heures, faites des coupes coronales de 400 μm à l’aide d’un vibratome, puis disséquez soigneusement la région d’intérêt dans le cerveau (par exemple, l’hippocampe) sous le microscope de dissection. Coupez soigneusement le tissu et prenez une photo pour préserver l’orientation.
   Note : Les méthodes de post-traitement de la coloration des tissus dans SBFSEM combinent une variété de méthodes de coloration des métaux lourds afin d’améliorer la résolution. .
7. Lavez les tissus fixés au glutaraldéhyde 3 fois, 5 min chacune, dans un tampon cacodylate 0,1 M (pH 7,2).
8. Préparez une solution d’acide tannique à 0,1 % en dissolvant l’acide tannique dans un tampon de cacodylate de sodium 0,1 M (pH 7,2). Agiter jusqu’à dissolution et filtrer à travers un filtre de 0,45 μm, si nécessaire.
9. Postfixer les tissus avec du cacodylate tamponné à 0,1 % d’acide tannique en incubant dans 1 ml de réactif pendant 30 à 60 min à RT.
   Note : Le temps d’incubation dépend de la taille des tissus, mais 30 minutes fonctionnent mieux pour la plupart des tissus.
10. Lavez les mouchoirs 3 fois, 5 min chacune, dans un tampon cacodylate (pH 7,2).
11. Dissoudre 0,3 g de ferrocyanure de potassium et 0,86 g de cacodylate de sodium dans 10 ml de H style='font-family :Arial,sans-serif ;font-size :0.6em ;font-style :normal ;font-variant :normal ;font-weight :400 ;text-decoration :none ;vertical-align :baseline ;white-space :pre-wrap ;'>₂O (dH₂O). Gardez la solution de ferrocyanure de potassium sur de la glace. Juste avant l’utilisation, ajoutez 10 ml de tétroxyde d’osmium à 4 % (OsO₄).
12. Teindre les tissus avec une solution d’osmium-ferrocyanure à 2 % pendant 90 min, sur de la glace. Laver 3 fois, 5 min chacune en dH₂O.
13. Préparez une solution de thiocarbohydrazide (TCH) à 1 % en dissolvant 0,1 g de TCH dans 10 ml de dH₂O. Dissoudre à 60 °C en remuant toutes les 10 minutes jusqu’à dissolution complète. Observez les précautions de sécurité lors de la manipulation du TCH, en particulier en prenant soin d’éviter l’utilisation de métaux, le chauffage à des températures élevées ou le séchage de la solution.
14. Traitez les échantillons avec 1 % TCH fraîchement préparé pendant 20 min à RT. Lavez 3 fois, 5 min chacune, en dH₂O.
15. Diluer 4 % OsO₄ à 2 % avec dH₂O, et colorer les tissus avec 2 % de tétroxyde d’osmium aqueux en incubant pendant 1 h. Lavage tissus 3 fois, 5 min chacune, avec dH₂O.
16. Incuber les échantillons O/N dans de l’acétate d’uranyle à 1 % en dH₂O à 4 °C.
17. Préparez la solution d’aspartate de plomb de Walton.
    1. Dissoudre 0,998 g de L-Aspartate dans 250 ml dH₂O et ensuite ajoutez 10 N d’hydroxyde de potassium (KOH) de manière goutte à goutte jusqu’à ce que le pH atteigne 5,5. Après ajustement du pH, ajouter 0,066 g de nitrate de plomb dans 10 ml de bouillon d’acide aspartique et chauffer à 60 °C pendant 30 min.
18. Rincez les mouchoirs en dH₂ et incuber avec la coloration au plomb aspartate de Walton pendant 30 min dans un four à 60 °C. Laver 3 fois, 5 min chacune, en dH₂O.
19. Déshydrater les échantillons à travers une série graduée d’alcool à l’aide de solutions réfrigérées d’éthanol à 20 %, 50 %, 75 %, 85 % et 95 % pendant 5 minutes chacune, puis d’éthanol à 100 % 3 fois pendant 10 minutes chacune.
    Note : Utilisez de l’éthanol à 100 % à partir de bouteilles fraîchement ouvertes, car l’éthanol ouvert absorbe l’eau de l’air et provoque l’échec de l’intégration. Des incubations plus longues seront nécessaires avec des échantillons de tissus plus grands.
20. Laver les échantillons 2 fois, 15 minutes chacune, dans de l’oxyde de propylène.
21. Fabriquer de la résine d’enrobage plastique à l’aide de 25 ml de résine, 10,5 ml de DDSA (anhydride dodécénylsuccinique), 15,5 ml de NMA (anhydride méthylique nadique) et 1 ml de DMP-30 (2,4,6-Tris diméthylaminométhylphénol). Mélangez la résine en secouant. Tournez et laissez la résine reposer jusqu’à ce que les bulles se dissolvent.
    Note : Il s’agit de la recette standard de dureté moyenne. D’autres types de résine plastique de microscopie électronique (EM) peuvent être utilisés, mais doivent être testés à l’avance avec un échantillon de contrôle non essentiel, car toutes les résines ne fonctionnent pas pour SBFSEM.
22. Incuber les tissus O/N dans un mélange 50:50 de résine d’enrobage et d’oxyde de propylène dans un flacon qui est initialement bouché et débouché après 2 heures afin que l’oxyde de propylène s’évapore sur une période d’environ 8 à 10 heures.
23. Transférez les mouchoirs dans de la résine d’enrobage 100 % fraîche dans des flacons propres pendant 2 heures.
24. Incorporez des échantillons dans de la résine d’enrobage fraîche, dans des moules plats contenant des étiquettes en papier imprimées, et durcissez-les dans un four à 60 °C pendant 48 heures. Après environ 1 heure, vérifiez à nouveau le placement et l’alignement des tissus et ajustez-les si nécessaire.
25. Coupez les échantillons à la zone d’intérêt et montez-les sur une goupille en aluminium à l’aide de superglue cyanoacrylate gélifiante ou d’une résine époxy conductrice. Ensuite, enduisez les côtés du bloc d’une pâte d’argent colloïdal pour fournir un chemin conducteur vers la broche en aluminium.
26. Examinez des échantillons de tissus à l’aide d’un système de microscope électronique à balayage équipé d’une platine d’ultramicrotome dans la chambre et d’un détecteur d’électrons rétrodiffusés à faible kV.
    Note : Obtenez une formation sur l’utilisation de l’instrument et du site sur l’utilisation de la microscopie électronique à balayage (MEB) et devenez un utilisateur autorisé. Une autre solution peut être possible en collaboration avec un chercheur ou une plateforme pour de petits projets. Une formation aux rayonnements peut également être nécessaire car les MEB génèrent des rayons X.
27. Pour imager les échantillons, utilisez les paramètres suivants : 2,25 kV, à une résolution de 5 à 10 nm/pixel, avec des tailles de champ comprises entre 80 et 250 μm en x,y (autres tailles de champ possibles) et une épaisseur de coupe de 50 à 100 nm, avec un total de 250 à 600 coupes sur une période de 16 à 20 heures.
    Note : paramètres varient considérablement entre les différents microscopes, les échantillons individuels et la résolution souhaitée. Ces paramètres doivent produire des images facilement interprétables pour de nombreux échantillons.

2. Analyse de l’ensemble de données d’imagerie

Remarque : Le logiciel Image J/Fiji est utilisé pour analyser l’ensemble de données et s’appuie sur le plugin TrakEM2. Les étapes de prétraitement peuvent être effectuées à l’aide d’une variété de logiciels et peuvent être étendues ou mineures selon le niveau d’expérience et les piles obtenues. Les principales transformations à l’aide du logiciel open source (ImageJ ver 1.50b, téléchargement FIJI Oct 1, 2015) sont décrites ici.

1. Convertissez les images au format tiff 8 bits à partir des images propriétaires originales de 16 bits en ouvrant le logiciel et en sélectionnant les éléments de menu Image→Type→8 bit.
   1. Si la conversion automatique du contraste/luminosité pendant cette étape n’est pas idéale pour les images, rouvrez les images 16 bits et appuyez sur Image→Ajuster→Luminosité/Contraste. Sélectionnez une plage qui fonctionne pour toutes les images, puis appuyez sur Appliquer. Effectuez ensuite la conversion. Note : Sur certains MEB, cette étape peut nécessiter un microscope logiciel du fabricant.
   2. Si nécessaire, en raison d’un déplacement d’image inacceptable entre les tranches (e.g. dérive due à la charge), enregistrer/aligner les piles d’images (éléments de menu Plugins→Registration→Linear StackAlignmentWithSIFT). Dans la plupart des logiciels d’enregistrement, réglez le mode « traduction uniquement » plutôt que « corps rigide ».
      Note : De nombreuses approches et logiciels peuvent fonctionner : le plug-in d’enregistrement SIFT fonctionne pour de nombreuses applications et il existe une version de pile virtuelle.
      1. Si nécessaire, agrandissez la taille du canevas avant l’enregistrement (Image→Adjust→CanvasSize) ou réduisez-la à une zone d’intérêt (Image→Crop).
         Note : Une certaine dérive ou un certain étalement peut se produire, et l’essai d’autres plugins ou logiciels peut produire de meilleurs résultats. Des options manuelles sont également disponibles (e.g<span style='font-family :Arial,sans-serif ;font-size :12pt ;font-style :normal ;font-variant :normal ;font-weight :400 ;text-decoration :none ;vertical-align :baseline ;white-space :pre-wrap ;'>. ImageJ/FIJI, Plugins→Enregistrement→ManuelLandmarkSelection).
   3. Si vous le souhaitez, mettez les images à l’échelle à une taille plus petite et plus gérable (e.g<span style='font-family :Arial,sans-serif ;font-size :12pt ;font-style :normal ;font-variant :normal ;font-weight :400 ;text-decoration :none ;vertical-align :baseline ;white-space :pre-wrap ;'>. 25 %) à l’aide de ImageJ (Image→Scale).

Matériaux