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Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par l’examen éthique animal approprié.1. Préparation du tissu rétinien (2 h)
NOTE : Toutes les procédures de cette section doivent être effectuées sous un éclairage rouge tamisé
- Adaptez les animaux à l’obscurité pendant au moins 1 h avant la dissection. Effectuez toutes les procédures sous un éclairage rouge tamisé.
- Euthanasier les animaux par CO2 asphyxie et énucléer les globes oculaires dans une boîte de Pétri avec une solution extracellulaire préalablement oxygénée.
- Piquez la cornée avec une aiguille et coupez-la en la coupant avec des ciseaux ophtalmiques à la limite de la cornée et de la sclère.
- Retirez l’objectif à l’aide d’une pince #5. Faites doucement une déchirure dans la sclérotique avec la pince et sectionnez le nerf optique à l’endroit où la rétine et la sclérotique se rencontrent. Terminez soigneusement l’élimination de la sclérotique de la rétine.
- Retirez le vitré transparent à l’aide d’une pince #5 ; Une fois retiré, le vitré apparaît comme une substance gélatineuse collée à la pince. Coupez les rétines en deux (de sorte qu’il y ait 4 morceaux/animal) et stockez-les dans une solution extracellulaire oxygénée à la RT jusqu’à l’utilisation.
- Lorsque vous êtes prêt à monter le tissu dans la chambre d’enregistrement, placez un morceau de rétine à incuber dans une solution enzymatique diluée dans 500 μL de solution extracellulaire oxygénée. Incuber dans une boîte de Pétri pendant 2 min à température ambiante (RT) sur un agitateur.
- Lavez le morceau de rétine dans une solution extracellulaire oxygénée et placez le tissu dans une chambre d’enregistrement à fond de verre ; utilisez une pipette de transfert en plastique avec la pointe coupée pour permettre à la rétine d’être transférée sans endommager le tissu.
- Utilisez une pince pour aplatir soigneusement le tissu avec la couche photoréceptrice vers le bas. Retirez l’excès de liquide à l’aide d’une pipette. Ancrez le tissu à l’aide d’un anneau en platine avec une maille de nylon.
NOTE : Cette méthode pourrait également être utilisée pour préparer le tissu à l’isolement de l’ARN à partir de cellules amacrines et bipolaires marquées. - Remplissez la chambre d’une solution extracellulaire oxygénée et montez-la sur une platine de microscope. Perfuser le tissu avec une solution extracellulaire oxygénée à raison de 2 à 4 mL/min.
3. Visualisation et ciblage des cellules ganglionnaires rétiniennes GFP+ (10 min)
NOTE : Toutes les procédures de cette section doivent être effectuées sous une lumière rouge tamisée
- Avant de commencer, tirez des micropipettes en verre (diamètre extérieur [OD] : 1.2 mm, diamètre intérieur [ID] : 0.69 mm) pour des enregistrements électrophysiologiques à l’aide d’un extracteur de micropipettes. Utilisez le protocole suivant pour les électrodes (veuillez noter que les paramètres doivent être ajustés en conséquence pour obtenir la résistance souhaitée et varient d’un extracteur à l’autre et avec différents verres) : Chaleur : Rampe +10 ; Traction : 0 ; Vel : 23 ; Délai : 1 ; Pression : 500 ; Boucle du programme : 5 fois. Assurez-vous que les pointes ont un diamètre de ~1 μm, avec des résistances de 2 à 4 MΩ pour cibler les grandes cellules et de 5 à 7 MΩ pour cibler les petites cellules.
- Observez la couche de cellules ganglionnaires à l’aide de l’optique IR-DIC (Infrared Differential Interference Contrast) (Figure 1A). Identifier la protéine fluorescente verte (GFP)+ les cellules ganglionnaires rétiniennes (RGC) à l’aide de l’épifluorescence (~480 nm) (Figure 1B).
- Localisez la pipette remplie de solution intracellulaire dans DIC. Appliquez une légère pression positive et des décalages de tension nuls sur l’amplificateur.
- Appuyez la micropipette en verre contre une cellule GFP+ et appliquez une pression négative pour former un joint GΩ entre la pipette et la membrane cellulaire. Appliquer les étapes de commande de tension de test (e.g., 5 mV) pour surveiller la résistance de l’étanchéité. Après avoir formé un joint stable, rompez la membrane en appliquant de brèves impulsions de pression négative pour accéder à la cellule entière.
- Attendez 1 à 2 minutes que les dendrites de la cellule se remplissent de traceur fluorescent.
NOTE : La cellule peut être typée morphologiquement en examinant la morphologie en épifluorescence (Figure 1C). Dans le cas des CGR exprimant la mélanopsine, la stratification dendritique dans la couche plexiforme interne est visualisée en examinant les dendrites remplies de traceur fluorescent sous éclairage épifluorescent et en déterminant si elles se stratifient loin du soma dans la sous-lame OFF (M1 ipRGC), près de la couche cellulaire ganglionnaire dans la sous-lamina ON (M2 et M4 ipRGC), ou les deux (M3 ipRGC). Cette observation, combinée à la taille des soma (les M4 ont des somas nettement grands par rapport à tous les autres sous-types ipRGC), permet d’identifier le type de cellule. Ainsi, cette technique permet d’identifier le type de cellule in vitro avant l’isolement de l’ARN. Cette méthode pourrait être modifiée pour d’autres protocoles d’identification de types cellulaires impliquant soit la morphologie dendritique, soit la physiologie cellulaire.