Imagerie par photoactivation par fluorescence du transport des neurofilaments dans les axones de souris myélinisés

Résumé

Source : Boyer, N. P. et al., imagerie et analyse du transport des neurofilaments dans le nerf tibial de souris excisé. J. Vis. Exp. (2020)
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p style='line-height :1.380000000000001 ;margin-bottom :0pt ;margin-top :0pt ;text-align :justify ;' dir='ltr'>Cette vidéo démontre la méthode de photoactivation par fluorescence pour analyser le transport des neurofilaments dans les axones myélinisés des nerfs périphériques. En suivant les neurofilaments verts photoactivés marqués au fluorophore, la technique fournit des informations sur le transport axonal dans les maladies neurodégénératives.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Préparation d’une solution saline pour nerfs

1. Préparez 100 mL de solution saline de Breuer : 98 mM de chlorure de sodium (NaCl), 1 mM de chlorure de potassium (KCl), 2 mM de dihydrogénophosphate de potassium (KH₂PO₄), 1 mM de sulfate de magnésium (MgSO₄), 1,5 mM de chlorure de calcium (CaCl₂), 5,6 % de D-glucose, 23,8 mM de bicarbonate de sodium (NaHCO₃) dans de l’eau doublement distillée.
2. Faites bouillir 95 % d’oxygène/5 % de dioxyde de carbone (carbogène) dans la solution saline pendant au moins 30 minutes avant utilisation. Les restes de solution saline peuvent être réutilisés dans la semaine ; Cependant, il doit être réoxygéné avant chaque utilisation.
3. Versez une solution saline oxygénée dans une seringue de 60 ml et assurez-vous qu’il reste un minimum d’air dans la seringue.

2. Assemblage initial de la chambre de perfusion nerveuse

1. Connectez la seringue et la tubulure comme indiqué dans Figure 1A, en plaçant le tube de sortie dans une fiole à déchets.
2. Placez le joint extérieur dans le boîtier de la chambre de perfusion, en vous assurant que les poteaux d’entrée et de sortie du débit sont alignés avec les trous du joint.
3. Posez le joint intérieur (silicone, 100 μm d’épaisseur) sur une lamelle circulaire #1.5 (40 mm de diamètre), en lissant soigneusement les plis du joint pour assurer une étanchéité parfaite. Pour faciliter l’assemblage ultérieur, placez la lamelle et le joint sur une serviette en papier ou une lingette de travail avec le joint vers le haut.

3. Dissection et préparation du nerf tibial de souris

1. Sacrifier l’animal par inhalation de dioxyde de carbone ou par une autre méthode approuvée par l’institution. Démarrez une minuterie lorsque l’animal cesse de bouger/respirer, car les expériences ne doivent être menées que dans les 3 heures suivant le sacrifice.
2. Vaporisez la fourrure avec de l’éthanol à 70 % et retirez-en autant que possible des pattes et du dos de l’animal à l’aide d’un rasoir électrique.
3. À l’aide d’une paire de grands ciseaux de dissection, faites une incision dorsale dans la peau près du milieu de la colonne vertébrale et continuez la coupe autour de la face ventrale de l’animal. À partir de cette coupe, réfléchissez lentement la peau des jambes en la tirant doucement loin du muscle et en coupant le fascia.
4. Placez l’animal en position couchée sur un plateau de dissection et épinglez les quatre pattes. En option, épinglez la queue pour réduire davantage les mouvements.
5. À l’aide de ciseaux de microdissection, faites une incision dans les muscles de la cuisse à mi-chemin entre la queue et le genou pour exposer le nerf sciatique. Assurez-vous que le nerf, qui est visible à travers le muscle, n’est pas coupé.
6. Étendez l’incision dorsalement et ventralement pour retirer le muscle. De même, retirez les muscles du mollet, en gardant les coupures peu profondes et courtes pour éviter d’endommager les nerfs.
7. Retirer les muscles jusqu’à ce que le nerf tibial soit complètement exposé à partir du point où il se ramifie du nerf sciatique (au niveau du genou) au talon (Figure 2A).
   REMARQUE : Dans toutes les étapes, y compris et après la dissection du nerf tibial, évitez l’exposition inutile à la lumière ambiante afin de minimiser l’activation accidentelle possible de la protéine fluorescente verte photoactivable (paGFP) dans le nerf.
8. Saisissez le nerf tibial à l’extrémité proximale de la colonne vertébrale à l’aide d’une paire de pinces et coupez le nerf à l’aide d’une paire de ciseaux de microdissection. En prenant soin de ne pas mettre de tension sur le nerf, soulevez-le loin du muscle, en coupant toutes les attaches.
9. Coupez l’extrémité distale de la colonne vertébrale du nerf tibial et transférez-la dans une petite boîte de Pétri de solution saline oxygénée à température ambiante. À partir de ce stade de la procédure, assurez-vous toujours de garder une trace des extrémités proximales et distales du nerf.
   REMARQUE : Une façon de le faire est de marquer l’extrémité distale du nerf avec une coupe inclinée de sorte que le cône soit visible.
10. En partant de l’extrémité proximale du nerf, saisissez doucement les extrémités axonales exposées à l’aide d’une paire de pinces à pointe très fine.
11. À l’aide d’une deuxième paire de pinces, saisissez la gaine nerveuse de manière proximale et tirez lentement vers l’extrémité distale du nerf. La gaine nerveuse glissera le long des axones avec une résistance minimale. Assurez-vous qu’aucune tension excessive n’est appliquée sur le nerf pendant ce processus.

4. Assemblage final de la chambre de perfusion nerveuse

1. Saisissant l’extrémité proximale du nerf, retirez-le de la solution saline et déposez-le lentement sur la lamelle de la chambre de perfusion dans l’ouverture rectangulaire du joint intérieur, en maintenant une légère tension sur le nerf pendant que vous le posez de manière à ce qu’il reste droit.
2. Placez la glissière du micro-aqueduc sur le nerf avec le côté rainuré face au nerf et la direction du flux parallèle au nerf. Retournez la lamelle et le microaqueduc et placez-le dans le boîtier de la chambre de perfusion avec la glissière du microaqueduc apposée sur le joint extérieur. Le nerf et le joint intérieur environnant seront désormais pris en sandwich entre la lamelle et la glissière du microaqueduc, qui sont séparées par le joint, avec la lamelle vers le haut (Figure 1B).
3. Fixez la chambre de perfusion en la plaçant dans le boîtier métallique et en tournant la bague de verrouillage. Assurez-vous que le boîtier en plastique est bien sous tous les clips métalliques et serrez bien pour éviter les fuites de solution saline. Un serrage excessif peut fissurer la glissière du microaqueduc ou la lamelle. Retournez la chambre de manière à ce que la lamelle soit tournée vers le bas.
4. Appuyez lentement sur le piston de la seringue saline pour remplir la chambre de perfusion. Gardez le tube d’entrée et de sortie, le flacon de sortie et la seringue surélevés au-dessus de la chambre elle-même à tout moment pendant la configuration et l’imagerie. Cela évite le siphonnage, qui peut introduire des bulles ou provoquer une instabilité de la mise au point en raison d’une pression négative dans la chambre.
5. Transférez l’ensemble de perfusion sur une platine de microscope inversé et montez la seringue saline dans le pousse-seringue. Démarrez le moteur à une vitesse appropriée pour un débit de 0,25 mL/min. Connectez et allumez ensuite le réchauffeur de solution en ligne réglé à 37 °C.
6. Connectez le réchauffeur d’objectif et réglez-le à 37 °C, appliquez de l’huile sur l’objectif et insérez la chambre de perfusion dans le support de scène.
7. Appliquez de l’huile sur le coussin chauffant de la chambre et fixez-le à la chambre de perfusion. Connectez et allumez le chauffe-chambre ; réglé à 37 °C.
   REMARQUE : Les changements de température peuvent provoquer la formation de bulles dans la chambre de perfusion en raison du dégazage de la solution. Si des bulles se forment, augmentez brièvement le débit de solution de 5 à 10 fois jusqu’à ce que les bulles quittent la chambre.
8. Verrouillez la chambre de perfusion dans l’adaptateur de platine et mettez l’huile de l’objectif en contact avec la lamelle située sur la face inférieure de la chambre.
   REMARQUE : La chambre Bioptechs avec adaptateur de platine ASI utilisée ici est conçue pour une configuration de microscope inversé.

5. Activation de la fluorescence et acquisition d’images

1. À l’aide d’un éclairage en fond clair, concentrez-vous sur la couche d’axones sur la surface inférieure du nerf la plus proche de la surface de la lamelle (Figure 2B). Les axones myélinisés (généralement de 1 à 6 μm de diamètre chez les souris adultes) peuvent être identifiés par la présence d’une gaine de myéline, qui est visible sous un éclairage en lumière transmise en fond clair sans amélioration du contraste. Les fentes et les nœuds de Schmidt-Lanterman sont également facilement apparents. Les axones non myélinisés sont plus minces (généralement <1 μm de diamètre) et sont généralement présents en faisceaux (faisceaux de Remak), où ils sont généralement trop étroitement apposés pour être résolus les uns des autres.
2. S’il est disponible sur le microscope, activez le système de mise au point automatique pour maintenir la mise au point au cours de l’imagerie en accéléré.
3. Acquérir une image de référence en fond clair. Enregistrer l’orientation du nerf (extrémités spinale-proximale et distale) par rapport aux images.
4. Acquérir une image confocale à l’aide d’un laser de 488 nm et d’un filtre d’émission approprié pour la paGFP (par exemple, 525/50 nm) pour enregistrer l’autofluorescence avant le blanchiment. Gardez la puissance du laser faible pour minimiser le photoblanchiment, avec le temps d’exposition ajusté en conséquence pour détecter le signal faible. À titre d’exemple, des données représentatives ont été acquises à une puissance laser de 5 % et à des expositions de 4 s. Enregistrez les paramètres d’acquisition pour les utiliser dans toutes les expériences futures.
   REMARQUE : Après la photoactivation, les paramètres d’imagerie idéaux produiront un rapport signal/bruit > 8 et un photoblanchiment inférieur à 25 % du signal d’origine sur 20 images. Les axones peuvent également être imagés par microscopie à épifluorescence à champ large comme nous l’avons fait à l’origine, mais la qualité de l’image sera inférieure en raison du manque de confocalité.
5. Réglez la puissance laser sur environ 5 fois la puissance d’imagerie normale et acquérez une image avec un temps d’exposition de 3 à 4 minutes. Bien qu’elle ne soit pas essentielle, cette étape est recommandée pour blanchir l’autofluorescence et d’autres sources de fluorescence indésirable afin de réduire le signal de fond et ainsi maximiser le rapport signal/bruit de la fluorescence photoactivée.
6. Acquérez une image avec les paramètres utilisés à l’étape 5.4 pour enregistrer l’autofluorescence de pré-activation après cette étape de blanchiment.
7. Sur l’image en fond clair, tracez une ligne parallèle aux axones d’une longueur égale à la taille de la fenêtre d’activation souhaitée. La longueur de cette fenêtre variera en fonction de l’objectif et des paramètres expérimentaux, mais les longueurs typiques sont de 5 μm pour le paradigme d’échappement d’impulsion et de 40 μm pour le paradigme d’étalement d’impulsion.
8. À l’aide de cette ligne comme guide, tracez une région d’intérêt (ROI) rectangulaire dans le champ de vision perpendiculaire aux axones. La région doit englober tous les axones à photoactiver.
9. Déterminez les paramètres optimaux pour la photoactivation avec un éclairage de 405 nm.
   REMARQUE : N’effectuez cette étape et les sous-étapes qu’avant la première activation expérimentale. Au cours d’une expérience, les mêmes paramètres de photoactivation doivent être utilisés.
   1. Activez une région d’intérêt à plusieurs reprises à l’aide de la raie laser de 405 nm, de la faible puissance laser (par exemple, 5 %) et du temps de séjour des pixels (par exemple, 40 μs), et d’une impulsion, en acquérant une image de la protéine fluorescente verte activée ou de la fluorescence GFP après chaque activation. Répétez l’opération jusqu’à ce que la fluorescence n’augmente plus, puis quantifiez la fluorescence dans une région d’intérêt pour chaque image.
   2. Tracez les intensités moyennes de fluorescence en fonction du nombre d’impulsions. Sélectionnez le nombre d’impulsions au-delà duquel la fluorescence n’augmente plus comme le nombre optimal d’impulsions pour l’activation.
10. Activez la fluorescence paGFP dans la région dessinée à l’étape 5.8 par excitation structurée avec une lumière de 405 nm. Assurez-vous qu’une image est acquise juste avant et juste après l’activation.
    REMARQUE : L’activation idéale de paGFP produira une région de fluorescence clairement définie avec des limites nettes contenues dans la région d’intérêt ou le retour d’intérêt.
11. Démarrez une minuterie de 1 minute à la fin de l’activation. Au bout d'1 minute, lancez l’acquisition d’une série timelapse.
    REMARQUE : Le délai de 1 minute est nécessaire pour tenir compte de l’augmentation de la fluorescence observée suite à la photoactivation de paGFP. Pour la méthode de propagation d’impulsions, une période d’acquisition de 5 à 10 minutes avec des intervalles de 30 secondes est suffisante pour mesurer les pentes initiales dans les fenêtres centrale et flanquante afin de mesurer la vitesse et la directionnalité. Pour la méthode d’échappement par impulsions, une période d’acquisition de 30 à 150 minutes avec des intervalles de 5 ou 10 minutes permet d’analyser le comportement de pause à long terme des filaments.
12. Enregistrez toutes les images acquises, ainsi que le retour d’investissement utilisé pour l’activation de la fluorescence.
13. Déplacez-vous vers une nouvelle région du nerf et répétez les étapes 5.1 à 5.11. Si la nouvelle région se trouve le long du même axone, elle doit se trouver à au moins 500 μm de la région précédemment activée pour éviter la détection de neurofilaments fluorescents qui se sont déplacés hors de l’autre région activée. L’acquisition du timelapse final doit se terminer avant la fin de la fenêtre de 3 heures.
    REMARQUE : Il est possible que la préparation soit viable pendant plus de 3 heures, mais nous ne l’avons pas confirmé. Avec une dissection et une préparation efficaces, entre cinq et huit séries d’images timelapse de 10 minutes peuvent être acquises dans cette fenêtre de 3 heures.
14. Une fois la dernière série d’images timelapse acquise, arrêtez l’écoulement de solution saline, débranchez la solution et les réchauffeurs de chambre, puis retirez l’appareil de perfusion de la platine du microscope.

Résultats

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
14 x 22 Joint rectangulaire 0.1mm	Bioptechs	1907-1422-100	Joint intérieur
Sigma	D6134
joint rond de 30mm avec trous	Bioptechs	1907-08-750	Joint extérieur
35 x 10mm dish	Thermo Fisher	153066	Dissection dishes
Bioptechs	40-1313-0319	<
seringue de 60mL - embout Luer-lock	BD	309653
Andor Revolution WD système confocal à disque rotatif	Andor		Équipé des systèmes Perfect Focus et FRAPPA
Chlorure de calcium	Fisher	C79
Coverslips	Fisher	12-541-B	Pour la diapositive fluorescéine
D-(+)-glucose solution	Sigma	G8769
Dissection des épingles	Fine Science Tools	26001-70
Pince de dissection	Fine Science Tools	11251-30	Pince à pointe fine
Dissection microscope	Zeiss	47 50 03
Bac de dissection avec cire	Ginsberg Scientific	568859
Ciseaux de dissection	Fine Science Tools	14061-09	Ciseaux de dissection initiale
Chambre de perfusion FCS2	Bioptechs	60319-02-03
Fluorescéine sodique	Fluka	46960
Chauffage de solution en ligne	Warner Instruments	SH27-B
Pince de laminectomie	Fine Science Tools	11223-20	Pince de dissection initiale<
Sulfate de magnésium	Sigma-Aldrich	M7506
Microaqueduct slide	Bioptechs	130119-5
Lames de microscope	Fisher	12-544-3	Pour diapositive de fluorescéine
Insert de platine de microscope	Instrumentation scientifique appliquée	I-3017
Système de chauffage d’objectif	Okolab		Oko Touch avec objectif collier
Huile d’objectif - type A	Nikon	discontinued
Plan Apo VC 100x 1.40 NA objectif	Nikon	MRD01901
Chlorure de potassium	Fisher	P217
Phosphate de potassium	Sigma-Aldrich	P0662
Bicarbonate de sodium	Sigma-Aldrich	S6297
Chlorure de sodium	Sigma-Aldrich	S7653	<
Pompe à seringue	Sage Instruments	Model 355
Adaptateur de tube - femelle	Small Parts Inc.	1005109
Adaptateur de tube - mâle	Small Parts Inc.	1005012
Tygon tubing	Bioptechs		1/16 » ID, 1/32 » d’épaisseur de paroi
Vannas spring scissors	Fine Science Tools	15018-10	ciseaux fins

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