Microscopie à deux photons pour l’imagerie de la morphologie neuronale chez un bébé souris

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le vétérinaire JoVE. <span style='font-family :Arial,sans-serif ;font-size :12pt ;font-style :normal ;font-variant :normal ;text-decoration :none ;vertical-align :baseline ;white-space :pre-wrap ;'>

1< span style='font-family :Roboto,sans-serif ;font-size :12pt ;font-style :normal ;font-variant :normal ;font-weight :400 ;text-decoration :none ;vertical-align :baseline ;white-space :pre-wrap ;'>. Préparation de la fenêtre crânienne

1. Anesthésie le chiot à l’aide d’isoflurane (1.0 % - 2.0 %) et vérifie le niveau d’anesthésie par un test de pincement de la queue.
2. Ouvrez soigneusement le crâne avec une lame de rasoir stérilisée en laissant la dure-mère intacte (1 mm de diamètre) (Figure 1C). Utilisez une éponge en gélatine (coupée en petits morceaux, environ < 2 mm3, à l’aide de ciseaux stérilisés, et appliquez-les à l’aide d’une pince à épiler) imbibée de tampon cortex (125 mmol/L de NaCl, 5 mmol/L de KCl, 10 mmol/L de glucose, 10 mmol/L de HEPES (4-(2-hydroxyéthyl)pipérazine-1-éthanesulfonique), 2 mmol/L de CaCl₂, et 2 mmol/L MgSO₄ ; pH 7.4 ; 300 mOsm/L ; température ambiante) pour arrêter le saignement. Lors de l’ouverture du crâne, appliquez un tampon cortex pour garder la surface du cerveau humide.
3. À l’aide d’une éponge en gélatine, retirez tout tampon et tout sang de la surface durale. À l’aide d’embouts jaunes, appliquez une fine couche d’agarose à 1,0 % à bas point de fusion (dissoute dans le tampon cortex). À l’aide d’une machine à blocs thermiques, maintenir la température de la solution d’agarose à 42 °C jusqu’à l’application.
   REMARQUE : Le drainage du tampon et du sang doit être effectué du côté de la craniotomie en veillant à ce que l’éponge de gélatine sèche n’entre pas en contact avec la dure-mère. Le non-respect de cette consigne peut endommager la dure-mère.
4. Appliquez une lamelle ronde en verre (n° 1, 3 mm de diamètre) sur la couche de gel d’agarose. Retirez toutes les bulles entre la lamelle et la couche de gel d’agarose en versant un excès de gel d’agarose entre elles. Retirez l’excès de gel qui dépasse de sous la lamelle à l’aide d’une pince à épiler (Figure 1D et1E).
5. Fixez la lamelle à l’aide de ciment dentaire (Figure 1F).
6. Mélangez la poudre de ciment et le liquide de ciment. Appliquez le mélange à l’aide d’embouts jaunes avant qu’il ne se solidifie. N’appliquez pas de ciment dentaire sur la dure-mère, car cela pourrait endommager le cerveau.
7. Fixez une barre de titane stérile (faite sur mesure, environ 30 mg, voir Figure 1G) sur l’os crânien à l’aide de ciment dentaire. Alignez la barre de titane et la lamelle (sur la surface de la dure-mère) en parallèle pour capturer facilement des images.
8. Couvrir le crâne exposé avec du ciment dentaire (Figure 1H).
9. Récupérez le chiot de l’anesthésie. Maintenez-le sur un radiateur (37 °C) jusqu’à ce que le ciment dentaire se soit solidifié (1 h).

2. Two-photon Imaging

1. Réglez la longueur d’onde du laser à deux photons. Pour l’excitation RFP (Red Fluorescent Protein), utilisez 1 000 nm (450 mW/mm2 à 400 μm de profondeur).
   NOTE : La puissance laser devrait être réduit à mesure que la position z augmente.
2. Essuyez la surface de la lamelle avec de l’éthanol à 70 %.
3. Anesthésie le chiot à l’aide d’isoflurane (1,5 % à 2,0 %) et vérifie le niveau d’anesthésie à l’aide d’un test de pincement de la queue.
4. Fixez le chiot à la plaque de titane sur la platine d’imagerie à l’aide d’une barre de titane sur la tête du chiot (Figure 2A et 2B). Ajustez la tête de manière à ce que la lamelle soit parallèle à l’objectif à l’aide de la platine du goniomètre (Figure 2B). Maintenez la température corporelle du chiot à l’aide d’un coussin chauffant (37 °C).
5. Réglez la concentration d’isoflurane sur 0,7 % - 1,0 %.
   NOTE : Une concentration très élevée d’isoflurane peut entraîner la mort accidentelle du petit pendant l’imagerie.
6. Placez la platine d’imagerie sous l’objectif (20X, NA 1.0) du microscope à deux photons (Figure 2B et 2C).
7. Appliquez une goutte d’eau sur la lamelle. Utilisez l’épifluorescence pour localiser les neurones marqués par des protéines fluorescentes dans la zone où la dure-mère a été exposée.
8. Acquérez des images de pile z à des intervalles de 1,4 μm. Pour l’imagerie neuronale de couche 4, réglez la largeur z sur 150 - 300 μm pour imager l’ensemble de la morphologie dendritique (Figure 2D et 2E). Utilisez un balayage lent et une moyenne pour obtenir des images claires montrant la morphologie neuronale (il faut généralement > 20 minutes pour acquérir la morphologie dendritique complète).
   REMARQUE : Les paramètres suivants sont recommandés pour l’imagerie. Longueur d’onde d’excitation : 1 000 nm, scanner : type galvanomètre, miroir dichroïque : 690 nm, filtre d’émission : bande passante 575 - 620 nm, détecteur : type GaAsP, réglage du gain > 100, taille de l’image > 512 x 512 μm, champ de vision > 600 x 600 μm, résolution des pixels < 1,2 μm.

Figure 1 : Chirurgie, préparation de la fenêtre crânienne et fixation de la barre en titane. (A) Ce panneau montre l’ablation de la peau recouvrant le crâne. (B) Ce panneau montre la fixation de l’espace entre la peau et le crâne. Veillez à ne pas appliquer le liant sur la zone d’imagerie. (C) Voici une image de la dure-mère exposée. Une lame de rasoir a été insérée entre le crâne et la dure-mère, et le crâne a été ouvert à gauche de la zone exposée (pointe de flèche). L’os peut ensuite être facilement retiré à l’aide d’une pince. (D) Il s’agit d’une conception schématique montrant une vue verticale de la fenêtre crânienne. L’espace entre le verre de couverture et la dure-mère est rempli d’une fine couche de gel d’agarose. La lamelle est fixée au crâne à l’aide de ciment dentaire. (E) Une lamelle de forme ronde est placée sur la couche de gel d’agarose. (F) Voici une image de la lamelle sécurisée. (G) Ce panneau montre le design de la barre de titane. La barre en titane contient deux trous de vis pour la fixation à la platine d’imagerie (voir Figure 2) et une pièce rectangulaire plate qui est fixée à la tête du chiot. (H) La partie rectangulaire de la barre en titane est fixée au crâne du chiot à l’aide de ciment dentaire.

Figure 2 : In vivo Imagerie à deux photons des neurones corticaux chez les souris néonatales. (A) Ce panneau montre la conception de la plaque de titane. La plaque en titane a deux trous de vis pour fixer la barre en titane et quatre trous de vis pour fixer l’étage du goniomètre, qui est placé sur la platine d’imagerie. Des vis de 2,5 mm (de diamètre) x 2 mm (de longueur) sont utilisées pour la fixation. (B) Il s’agit d’une image représentative du chiot attachée à la scène d’imagerie. La température corporelle du chiot est maintenue à l’aide d’un appareil de chauffage. (C) Le petit est anesthésié à l’aide d’isoflurane pendant la procédure d’imagerie in vivo. (D) Ce panneau montre une image time-lapse représentative de la pile Z des neurones corticaux de couche 4 d’un chiot P5. La pointe de flèche indique le neurone avec des dendrites floues, qui doit être retiré de l’analyse. (E) Ce panneau montre des images time-lapse à plus fort grossissement du neurone avec des flèches dans le panneau D. Pointes de flèches bleues : pointes dendritiques qui se rétractent en 4,5 h, pointes jaunes : pointes dendritiques qui s’allongent en 4,5 h, petites pointes de flèches blanches : axone d’une cellule voisine. (F) Il s’agit d’un modèle 3D de la trace dendritique du neurone dans la figure de gauche du panneau E. Les cercles bleus indiquent la position du corps de la cellule. (G) Ce panneau montre des neurones représentatifs avec des dendrites déconnectées, qui ne sont pas incluses dans l’analyse. Les données d’échantillon dans les panels D - G contiennent des neurones NR1 (une sous-unité essentielle du récepteur du glutamate de type NMDA) inactivés (en raison des données limitées disponibles auprès des auteurs).