Ablation neuronale ciblée par microscopie à deux photons dans un larava de poisson-zèbre

Résumé

Source : Muto, A., et al. Ablation d’une population neuronale à l’aide d’un laser à deux photons et son évaluation à l’aide de l’imagerie calcique et de l’enregistrement comportemental chez les larves de poisson-zèbre. J. vis. exp. (2018)

Dans cette vidéo, une procédure d’ablation laser à deux photons est démontrée, permettant la destruction sélective des neurones fluorescents chez les larves de poisson-zèbre immobilisées par l’agarose. L’imagerie à haute résolution avant et après l’intervention confirme l’efficacité des lésions neuronales, comme l’observe l’absence de fluorescence.

Protocole

1. Ablation d’une sous-population de neurones à l’aide d’un microscope laser à deux photons

1. Commencez par configurer l’accouplement d’une ligne Gal4 qui étiquette les neurones spécifiques à étudier et UAS :EGFP ou UAShspzGCaMP6s. Assurez-vous d’utiliser le fond d’écran nacre pour les deux parents afin que nacre homozygotes puissent être obtenus.
   NOTE : Les homozygotes de nacre ne contiennent aucun mélanophore sur la surface du corps (Figure 1B). Dans la présente étude, une lignée Gal4 gSAIzGFFM119B (qui marque le prétectum) et une autre lignée Gal4 hspGFFDMC76A (qui marque l’ILH (Lobe de l’hypothalamus) sont utilisées.

2. Le lendemain de l’accouplement, collectez les œufs de poisson-zèbre et élevez-les jusqu’au stade larvaire, moment où les neurones d’intérêt exprimeront des rapporteurs fluorescents.

3. Montez la larve de poisson-zèbre dans 2 % d’agarose à faible point de fusion (Figure 1B).

1. Commencer par préparer une solution mère d’agarose à 2 % : dissoudre 2 g de poudre d’agarose à bas point de fusion dans 100 mL d’eau du système (i.e., l’eau utilisée pour maintenir le poisson-zèbre adulte dans un système d’eau en circulation) ou E3, en portant l’eau à ébullition au micro-ondes, et en mélangeant vigoureusement.

   1. Passez au micro-ondes le bouillon d’agarose à bas point de fusion à 2 % jusqu’à ébullition. Versez 3,5 à 4,0 ml d’agarose sur le couvercle d’une boîte de Pétri de 6 cm. Attendez que l’agarose refroidisse pour qu’elle soit chaude au toucher avant de continuer.

   2. Ensuite, placez une seule larve (non anesthésiée à cette étape) dans l’agarose. Continuez à ajuster la position et l’orientation de la larve de manière à ce qu’elle soit droite, à l’aide d’une aiguille de dissection (figure 1C), jusqu’à ce que l’agarose se solidifie pour assurer le bon positionnement de la larve.
      NOTE : La larve continuera à nager pendant que l’agarose se solidifiera.

   3. Une fois la larve positionnée, attendez 5 min pour que l’agarose se solidifie complètement.

   4. Versez 5 mL de solution de tricaïne (0.4 % à 1x la concentration de travail) sur l’agarose.
      NOTE : Pour éviter les mouvements des larves pendant l’ablation au laser, les larves doivent être maintenues anesthésiées tout au long de la procédure d’ablation.

4. < style style='couleur :#1A202C ;'>Ablate la larve en utilisant la fonction de blanchiment dans un système de microscopie laser à deux photons.

1. Placez la larve incrustée d’agarose sous un microscope à balayage laser à deux photons et démarrez le système de microscopie.

2. Démarrez le logiciel d’acquisition d’images et cliquez sur le bouton « On » de l’onglet « Laser » pour allumer le laser (Figure 1D). Attendez que l’état du laser passe de « Occupé » à « Verrouillé ».

3. Dans l’onglet « Channels », réglez la longueur d’onde du laser à 880 nm (puissance maximale : environ 2 300 mW) pour l’ablation EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein), ou à 800 nm (puissance maximale : environ 2 600 mW) pour l’ablation GCaMP.

4. Sélectionnez l’objectif 20X en déplaçant manuellement le revolver de l’objectif. Cliquez sur l’onglet « Localiser », cliquez sur « GFP » (Green Fluorescent Protein) pour modifier les voies optiques et visualiser directement la fluorescence à l’œil nu.

5. Localisez le cerveau larvaire du poisson-zèbre au centre de la vue ; puis cliquez sur l’onglet « Acquisition » pour revenir à la microscopie à deux photons.

6. Pour enregistrer la condition 'avant ablation', prenez une image z-stack avec l’objectif 20X à une vitesse de balayage rapide (pour éviter les dommages causés par la chaleur). Comparez plus tard les images prises avant et après les expériences d’ablation (Figure 2A). Pour obtenir une pile z, cliquez sur « Z-Stack » pour sélectionner l’option de pile z et développer l’onglet. Réglez la limite inférieure (cliquez sur le bouton « Définir en premier ») après vous être concentré sur l’extrémité ventrale du cerveau larvaire, et réglez la limite supérieure (cliquez sur le bouton « Définir en dernier ») après avoir mis l’accent sur la surface la plus dorsale du cerveau. Ensuite, cliquez sur le bouton « Démarrer l’expérience » pour exécuter l’acquisition d’images z-stack.

7. Sélectionnez l’objectif 63X en déplaçant manuellement le revolver de l’objectif.

8. Cliquez sur l’onglet « Localiser » pour passer à la microscopie épi-fluorescente, localisez les cellules à ablater au centre de la vue par l’œil, puis cliquez sur l’onglet « Acquisition » pour revenir à la microscopie à balayage laser.

5. Dans l’onglet « Mode d’acquisition », réglez la « Taille du cadre » à 256 x 256. Cliquez sur « Live » et observez les neurones qui vous intéressent.

6. En commençant par le côté le plus dorsal, trouvez un plan focal dans lequel les cellules à ablater sont nettes.

7. Marquez une petite zone circulaire d’environ un tiers du diamètre de la cellule sur chaque neurone comme une région d’intérêt (ROI) à l’aide de la fonction « Regions ».

8. < style de police='famille-de-police :Roboto ;taille-de-police :12.0pt ;' lang='EN-US'>Réglez la vitesse de balayage à 13.93 s/256 x 256 pixels (134.42 μm x 134.42 μm), ce qui correspond à un temps de séjour laser d’environ 200 μs/pixel, ou 200 μs/0.5 μm. Réglez également 4 répétitions ('Cycle d’itération : 4'). Vous pouvez également optimiser le nombre d’itérations et la vitesse de balayage afin d’obtenir une ablation suffisante.

9. Effectuez la fonction 'Bleaching' pour l’ablation, en combinaison avec la 'série temporelle (2 cycles)' pour imager l’échantillon (avant et après l’ablation) et 'Regions' (pour définir les ROI) ou des fonctions équivalentes dans le logiciel utilisé (Figure 1D) .

10. En comparant la première image (avant l’ablation) et la deuxième image (après l’ablation) dans le cycle de la série chronologique, assurez-vous qu’après le blanchiment, la fluorescence dans les cellules ciblées diminue jusqu’à celle observée au niveau de l’arrière-plan (Figure 2B).

11. Si la fluorescence est toujours présente après l’ablation, augmentez le nombre d’itérations.

12. Ensuite, déplacez légèrement le plan focal (i.e., vers le côté ventral), et choisissez le plan focal suivant où les cellules non ablées apparaissent.

13. Effectuer la fonction de blanchiment. Répétez ces étapes jusqu’à ce que toutes les cellules de la structure neurale d’intérêt aient été enlevées.

14. Après avoir parcouru tous les plans focaux couvrant les structures neurales à ablater, vérifiez que les cellules ne sont pas en fluorescence abolie. Si certaines cellules sont encore fluorescentes en raison d’une ablation insuffisante, irradiez-les à nouveau au laser comme décrit ci-dessus.

15. Si la larve doit être récupérée de l’agarose après l’irradiation laser, n’essayez pas de la forcer à sortir de l’agarose car cela pourrait endommager la larve. Au lieu de cela, faites soigneusement de minuscules incisions dans l’agarose autour de la larve perpendiculairement à la surface de son corps. Ensuite, attendez que la larve sorte de l’agarose d’elle-même lorsque l’anesthésique se dissipe.

16. Passez à la larve suivante pour l’ablation ou effectuez des expériences de contrôle en utilisant une autre population de neurones qui ne sont pas impliqués dans le comportement étudié.
    NOTE : Ici, en tant que contrôle, les neurones du bulbe olfactif dans les larves de UAS :EGFP ; gSAIzGFFM119B ont été ablatés au laser en utilisant le même protocole décrit ci-dessus (Figure 2A, à droite).

17. Prévoyez plusieurs heures ou 1 jour pour la récupération avant de passer à l’imagerie Ca ou à l’enregistrement comportemental. Pendant ce temps de récupération, vérifiez la santé des larves (i.e., nage spontanée normale, pas de dommages thermiques apparents autour de la zone ablée, etc.) et retirez les larves présentant des signes de mauvaise santé.

Résultats

Matériaux