Microscopie à deux photons pour l’imagerie in vivo de la microvascularisation du cerveau de souris

Résumé

Source : Nishimura, C. et al. Quantification de l’architecture vasculaire cérébrale à l’aide de la microscopie à deux photons dans un modèle murin de neuroinflammation induite par le VIH. J. Vis. Exp. (2016).

Cette vidéo démontre la visualisation in vivo des capillaires corticaux dans le cerveau de la souris à l’aide de la microscopie à deux photons. Il décrit les étapes à suivre pour injecter un colorant fluorescent dans une souris anesthésiée avec une fenêtre corticale crânienne mince, préparer la configuration pour l’imagerie et acquérir des images détaillées des structures microvasculaires cérébrales pour l’analyse.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le conseil d’examen vétérinaire JoVE.

1. Injection du colorant fluorescent

1. Pincez la peau d’une souris anesthésiée sur la cuisse médiale gauche à l’aide de la pince #5. Tirez doucement la peau vers le haut et utilisez des ciseaux pour couper et enlever la peau. Préparez un colorant à la rhodamine conjugué au dextran (70 kDa) (10 mg/kg dissous dans une solution saline).
2. Localiser la veine fémorale. À l’aide d’une seringue de 1 ml munie d’une aiguille de 30 G, prélever une solution préalablement préparée d’un colorant fluorescent approprié pour l’imagerie sur la ligne de 130 μl de la seringue. Éliminez toutes les bulles d’air en aspirant complètement le colorant dans la seringue et en effleurant fermement la paroi de la seringue.
   1. Pliez l’aiguille de 30 G à un angle d’environ 30 degrés en la pressant contre une surface dure, côté biseau vers le haut. Remplissez l’aiguille avec le colorant et jetez tout excès de liquide, en laissant un échantillon de 100 μl.
3. Injectez lentement l’échantillon de 100 μl de colorant dans la veine fémorale. Après avoir retiré l’aiguille, appliquez une pression constante et douce sur le site d’injection pour arrêter tout saignement. Laissez le colorant circuler pendant 5 min.
4. Fermez la cuisse gauche en cousant la peau avec une suture 4-0, puis retournez délicatement la souris sur son ventre et placez-la dans le harnais de la plaque de tête de souris.
   

2. In vivo Imagerie à deux photons

1. Déplacer l’appareil chirurgical vers le microscope à deux photons, en s’assurant de maintenir des niveaux d’anesthésie continus. Placez une petite quantité de solution saline à 0,9 % dans le réservoir de la plaque frontale et abaissez l’objectif du microscope de manière à ce qu’il entre en contact avec la solution saline. Localisez la zone d’intérêt à l’aide de l’objectif d’observation en fond clair.
2. Réglez l’excitation laser à deux photons sur une longueur d’onde appropriée pour le colorant fluorescent. Commencez l’imagerie à deux photons à l’aide de l’objectif 25x.
   Notez que dans ces expériences, nous avons utilisé un dextran conjugué à un colorant de rhodamine émettant du rouge qui a été excité à une longueur d’onde de 780 nm. Un filtre d’émission passe-bande 607/36 a été utilisé pour détecter la fluorescence du colorant, et un filtre d’émission passe-bande 480/20 a été utilisé pour détecter l’autofluorescence artérielle.
3. Localisez un lit capillaire sur l’écran de visualisation et agrandissez cette zone à l’aide du zoom optique 2. Acquérez des images des capillaires à l’aide du logiciel d’imagerie à deux photons.

Matériaux