$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Acquisition des données FLIM
REMARQUE : Dans ce protocole, la durée de vie du fluorophore est acquise par la méthode TCSPC dans le domaine temporel. FLIM nécessite qu’une impulsion lumineuse soit générée par le laser à un taux de répétition défini et constant. Le taux de répétition varie en fonction du type de laser et doit être connu de l’utilisateur. Les mesures à vie sont réalisées par des détecteurs et des équipements électroniques installés à côté d’un microscope classique. Dans ce protocole, les mesures sont effectuées sur trois microscopes confocaux à balayage laser différents, avec des détecteurs et un logiciel fournis par deux sociétés différentes (Table des matériaux) pour l’acquisition des durées de vie mRFP, CFP et YFP, respectivement. Vérifiez que les bons filtres d’émission/excitation sont en place et minimisez tout arrière-plan ou rétroéclairage du moniteur avant de commencer. Avant de commencer toute expérience, établissez la photostabilité du fluorophore choisi. Si le fluorophore blanchit en peu de temps dans les tissus du nématode, il ne convient pas aux mesures FLIM dans C. elegans.
- Ouvrez le logiciel d’acquisition FLIM. Le logiciel FLIM permet également de contrôler le microscope confocal. Localisez l’onglet/le bouton pour permettre d’activer les sorties du détecteur et appuyez sur Activer les sorties.
- Acquérez la fonction de réponse de l’instrument (IRF), qui décrit la précision de synchronisation de la configuration instrumentale.
REMARQUE : Cette étape doit être effectuée de préférence avant de monter les nématodes. - Le cas échéant, retirez les filtres d’excitation/émission.
- Placez une lamelle vide au-dessus de l’objectif et trouvez sa surface. Enregistrer le signal de diffusion obtenu à partir de la lamelle pendant au moins 30 s.
REMARQUE : Pour des durées de vie de plusieurs nanosecondes, le logiciel d’acquisition peut estimer automatiquement le décalage IRF. L’acquisition d’un IRF est toujours recommandée.
- Placez la diapositive avec le C. elegans sur la scène. À l’aide d’un objectif de grossissement 10x en mode transmission et localisez la position des nématodes sur la lame.
- Retirez la glissière, mettez l’objectif sur un objectif à grossissement 63x et appliquez le milieu d’immersion requis (par exemple, de l’huile). Replacez la lame sur la platine et localisez les nématodes.
- Localisez le {}}TAG_105{TAG_106}} sur le logiciel d’acquisition et ouvrez-le au Maximum. Commencez à balayer l’échantillon, sélectionnez une région d’intérêt (par exemple, la tête, le haut du corps) et concentrez-vous sur son plan de projection maximal.
- Surveillez la fréquence d’impulsion laser et les trois autres valeurs présentes sur l’interface du logiciel : le discriminateur de fraction constante (CFD), le {{}}{TAG_129}} (TAC), et le convertisseur analogique-numérique{{TAG_135 TAG_132}}{}} (ADC).
REMARQUE : Le laser doit avoir une porte maximale de 1 x 108 nombre de photons uniques. Ce nombre représente le nombre maximum de photons fournis par le laser. Le CFD fournit des informations sur la réception de l’impulsion de photon unique en référence à l’impulsion laser par le détecteur. Cette valeur doit être d’environ 1 x 105. Le TAC fait la distinction entre le moment où un photon a été détecté et l’impulsion laser suivante. Enfin, l’ADC convertit la tension TAC en un signal de mémoire stockable. Le CFD, le TAC et l’ADC doivent tous avoir des valeurs similaires pour s’assurer que les photons émis par le fluorophore ne sont pas perdus. L’évaluation correcte de ces paramètres garantit qu’un nombre suffisant de photons sont collectés pour créer une carte précise de la durée de vie. - Sur l’interface du logiciel FLIM, prévisualisez le nombre de photons détectés : la valeur ADC doit être comprise entre 1 x 104 et 1 x 105. Si nécessaire, déplacez la mise au point sur un autre plan ou augmentez la puissance du laser pour collecter plus de photons.
REMARQUE : En général, le nombre de photons enregistrés par seconde ne doit pas dépasser 1 % du taux de répétition du laser. - Dans la barre de menus, sélectionnez l’onglet permettant de définir les paramètres d’acquisition. Sélectionnez scan sync pour permettre la détection d’un seul photon.
- Réglez l’acquisition sur une durée fixe ou un nombre fixe de photons. Par exemple, acquérez une courbe de décroissance sur la durée de vie pendant 2 minutes ou jusqu’à ce qu’un seul pixel atteigne un nombre de photons de 2 000 événements uniques. Appuyez sur Start pour commencer l’acquisition.
REMARQUE : Différents fluorophores nécessiteront des lasers et des filtres d’excitation et d’émission différents. En fonction de la luminosité de l’échantillon, la puissance du laser peut également être ajustée, ce qui n’interférera pas avec la durée de vie. Ces protocoles utilisent les paramètres d’excitation/émission suivants : YFP ex500/em520-50 nm, mRFP ex561/em580-620 nm. Un laser à deux photons pulsés a été utilisé pour les mesures CFP en utilisant ex800/em440 nm. Le temps et le nombre de photons nécessaires à l’acquisition d’une carte FLIM devront être établis empiriquement pour chaque configuration et chaque objectif expérimental.
2. Analyse des données FLIM à l’aide du logiciel FLIMfit
{{TAG_233 TAG_234}}REMARQUE : Effectuer l’analyse des données à l’aide de l’outil logiciel FLIMfit développé à l’Imperial College de Londres (voir Figure 1).
- Ouvrez le logiciel et importez les fichiers de données FLIM via Fichier | Charger les données FLIM. Chargez tous les échantillons à partir d’une condition, même s’ils ont été obtenus lors de différentes sessions et à partir de différentes répétitions biologiques.
- Si nécessaire, segmentez un seul nématode à partir de n’importe quelle image FLIM via Segmentation | Gestionnaire de segmentation. Faites glisser l’outil de recadrage autour de la zone d’intérêt jusqu’à ce qu’elle soit mise en surbrillance. Une fois terminé, appuyez sur OK.
REMARQUE : La segmentation doit être effectuée pour toutes les images. - Sélectionnez une petite région où l’image basée sur l’intensité d’un C. elegans apparaît (Figure 1, flèches 1). La courbe de décroissance de cette région apparaîtra dans la grande fenêtre de décroissance sur le côté droit de l’interface (Figure 1, flèche 2).
REMARQUE : La décomposition peut être affichée de manière linéaire ou logarithmique. - Définissez les paramètres corrects pour extrapoler la durée de vie via l’algorithme du logiciel, comme décrit aux étapes 2.5 à 2.8.
- Sur l’onglet Données ({TAG_335}}Figure 1, flèche 3) :
- Définissez une valeur minimale {{TAG_350 TAG_347}}{TAG_352 TAG_351{TAG_349}} intégrée pour exclure les pixels trop sombres pour produire une valeur Bon ajustement. Selon l’échantillon C. elegans, cette valeur varie de 40 à 300. Entrez différentes valeurs jusqu’à ce qu’un aperçu satisfaisant soit obtenu.
- Sélectionnez un nombre de Temps minimum et un nombre de {{TAG_374 TAG_375}}{{}} pour limiter le signal FLIM à ces valeurs. Tous les événements qui apparaissent avant et après ce seuil seront exclus.
REMARQUE : Par exemple, pour l’analyse de mRFP, les événements antérieurs à 800 ps et postérieurs à 4 000 ps ont été exclus. Ces valeurs dépendent de la durée de vie du fluorophore et doivent être déterminées par l’utilisateur final. - Ne modifiez pas le préréglage Counts/Photon de 1.
- Entrez le Taux de répétition, en MHz, du laser utilisé lors de l’acquisition.
NOTE : Pour le protocole actuel, différents lasers ont été utilisés avec différents taux de répétition. Le laser à deux photons utilisé pour l’acquisition des durées de vie CFP possède un taux de répétition de 80 MHz, pour YFP, le laser se répète à 40 MHz et pour mRFP, la valeur est de 78,01 MHz. Ces valeurs ont été saisies dans FLIMfit en fonction de l’échantillon analysé. - Entrez une valeur Gate Max pour exclure tous les pixels saturés.
REMARQUE : Pour les mesures de durée de vie en C. elegans, cette valeur est définie sur n’importe quel grand nombre (par exemple, 1 x 108{TAG_451}}).
- Dans l’onglet Lifetime), sélectionnez un ajustement global à utiliser (par exemple, un ajustement au pixel). Voir Figure 1, flèche 4.
REMARQUE : Un ajustement {TAG_484}}} produira une décroissance ajustée à chaque pixel individuel. Un ajustement Image produira un ajustement global de chaque image individuelle et affichera une seule valeur de durée de vie par image. Un ajustement Global-wise produira un seul ajustement sur l’ensemble du jeu de données. Une seule valeur de durée de vie est fournie pour toutes les images. - Ne modifiez aucun autre paramètre à l’exception du Non. Exp si l’on sait que la décroissance de fluorescence choisie est multiexponentielle et présente plus d’une seule durée de vie.
REMARQUE : Dans le protocole actuel, cette fonction était utilisée pour calculer les durées de vie du fluorophore biexponentiel CFP. - Téléchargez l’IRF via le menu IRF : IRF | Chargez IRF. Pour estimer le décalage IRF, sélectionnez IRF | Estimation du décalage IRF. Un ensemble de valeurs apparaîtra automatiquement sur l’onglet IRF. Une fois cela établi, ne modifiez aucun autre paramètre de cet onglet.
- Une fois tous les paramètres définis, appuyez sur Ajuster le jeu de données (Figure 1, Flèche 5). L’algorithme produira un ajustement pour la courbe de décroissance et établira une valeur de durée de vie pour chaque image.
REMARQUE : L’ajustement résultant, mis en évidence par une ligne bleue, doit chevaucher tous les événements. Un bon ajustement est obtenu lorsque tous les événements sont alignés le long de l’ajustement. - Cliquez sur l’onglet Parameters ({TAG_583}}Figure 1, flèche 6), situé dans les menus en haut à droite de l’interface du logiciel, et sélectionnez Statistique : w_mean (moyenne pondérée) et vérifiez que le {{}}chi2{{ TAG_598}} est aussi proche que possible de 1.
REMARQUE : Un chi2 proche de l’un assure la précision de l’ajustement. La valeur à vie de l’image sélectionnée est ainsi révélée sous la forme tau_1. - Exporter toute information qui vous intéresse : Fichier | Exporter les images d’intensité/ajuster la table des résultats/images/histogrammes. Enregistrez les paramètres de données utilisés pour calculer la durée de vie : Fichier | Enregistrer les paramètres de données.
REMARQUE : Les paramètres utilisés seront sauvegardés pour une analyse future des échantillons sélectionnés.
3. Représentations graphiques des données FLIM
REMARQUE : Les durées de vie collectées à partir de différents échantillons peuvent être représentées visuellement de différentes manières. Sélectionnez cette option pour indiquer les valeurs de durée de vie en nanosecondes ou en picosecondes.
- Montrez la qualité de l’ajustement et la précision de la courbe en exportant la courbe de décroissance directement depuis FLIMfit.
- Représentez la distribution des photons en traçant la fréquence du nombre de photons en fonction de la valeur de durée de vie dans un histogramme.
- Enfin, à des fins de comparaison statistique, si vous comparez deux échantillons ou plus, placez les valeurs de durée de vie plus l’écart-type de la moyenne dans un graphique à barres de nuage de points. Effectuez toute analyse statistique souhaitée.
