Visualisation d’un thrombus cérébral chez une souris à l’aide de l’imagerie par micro-tomodensitométrie

Abstract

Source : Kim, D., et. al. Imagerie fluorescente proche infrarouge combinée et micro-tomodensitométrie pour la visualisation directe de thromboembolis cérébraux. J. Vis. Exp. (2016)

Cette vidéo montre la visualisation d’un thrombus cérébral chez la souris à l’aide de l’imagerie par micro-tomodensitométrie (micro-CT). Un modèle de souris à thrombus cérébral est injecté avec des nanoparticules d’or ciblées sur la fibrine agissant comme un agent de contraste. La souris est placée sur le lit d’un appareil de micro-tomodensitométrie, et les images sont acquises sous plusieurs angles. À l’aide d’un logiciel approprié, les images sont reconstruites et traitées.

Protocol

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Préparation d’un caillot exogène marqué avec un marqueur de fluorescence (Figure 1)

1. Anesthésier une souris dans une chambre d’induction en utilisant 3 % d’isoflurane mélangé à 30 % d’oxygène (1,5 L/min 100 % d’oxygène). Assurez-vous d’une profondeur d’anesthésie adéquate en observant le tonus musculaire et en confirmant l’absence de réflexe de pincement de l’orteil.
2. Placez l’animal sur un champ stérile en position couchée et maintenez-le sous anesthésie à l’aide d’un masque d’inhalation et de 2 % d’isoflurane mélangé à 30 % d’oxygène. Effectuer les procédures suivantes en utilisant des techniques aseptiques et des blouses/masques/gants/instruments stériles. Maintenir des conditions stériles en nettoyant et en désinfectant la zone d’expérimentation avec de l’alcool à 70 % avant et après les procédures.
3. Prélever environ 300 ~ 1 000 μl de sang artériel après une ponction cardiaque. Mélangez 70 μl de sang total avec une sonde C15 de 30 μl (concentration de 20 μmol/L), une sonde fluorescente Cy5.5 sensible à l’activité de réticulation de la fibrine de l’enzyme de coagulation du facteur XIII activé (FXIIIa), pour marquer par fluorescence le caillot (Figure 1A). Injecter le sang mélangé à l’aide d’une seringue de 3 ml (aiguille de calibre 23) dans un tube en polyéthylène de 20 cm de long (PE-50, D.I. 0,58 mm). Les tubes en PE doivent être stérilisés (ou certifiés stériles par le fabricant) et les caillots doivent être préparés de manière aseptique dans une hotte de culture tissulaire.
4. Vérifier la mort de l’animal en observant l’absence de respiration et de pouls cardiaque.
5. Laissez le tube chargé de sang à température ambiante pendant 2 heures, puis à 4 °C pendant 22 heures, et effectuez les procédures suivantes, comme indiqué précédemment.
6. Coupez le tube contenant le thrombus en morceaux de 1,5 cm de long. À l’aide d’une seringue de 3 ml remplie d’une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), expulsez le thrombus sur une plaque à 6 puits contenant du PBS en injectant doucement du PBS dans chaque morceau de tube. Lavez les thrombus trois fois avec du PBS (Figure 1B).
7. Chargez la partie distale de l’extrémité distale d’un tube PE-10 de 15 cm de long (D.E. 0,28 mm) avec un thrombus de 1,5 cm de long en aspirant soigneusement le thrombus lavé, tout en évitant les bulles d’air, à l’aide d’une seringue de 1 ml remplie de solution saline avec une aiguille de calibre 30 qui est insérée dans l’extrémité proximale du tube.
8. Connectez la sonde PE-10 chargée d’un thrombus à une sonde PE-50 de 3 cm de long (D.E. 0,58 mm) modifiée pour avoir une extrémité effilée (D.E. 200 μm), qui sera placée sur la zone de bifurcation de l’artère cérébrale moyenne (ACM) et de l’artère cérébrale antérieure (ACA) de l’artère carotide interne (ICA) dans un modèle murin d’AVC embolique (Figure 1C).

2. Modélisation d’un modèle murin d’AVC thromboembolique (Figure 2)

1. Anesthésier une souris différente à caresser dans une chambre d’induction en utilisant 3 % d’isoflurane mélangé à 30 % d’oxygène (1,5 L/min). Injecter du méloxicam (5 mg/kg) par voie sous-cutanée pour soulager la douleur post-chirurgicale. Assurez-vous d’une profondeur d’anesthésie adéquate en observant le tonus musculaire et en confirmant l’absence de réflexe de pincement de l’orteil.
2. Appliquez une petite quantité de pommade vétérinaire sur chaque œil pour prévenir la sécheresse pendant l’anesthésie. Effectuer les interventions chirurgicales suivantes en utilisant des techniques aseptiques et des blouses/masques/gants/instruments stériles. Maintenez des conditions stériles en nettoyant et en désinfectant la zone chirurgicale avec de l’alcool à 70 % avant, pendant et après la chirurgie.
3. Déplacez la souris sur une table d’opération. Placez l’animal sur un champ stérile en position couchée et maintenez-le sous anesthésie à l’aide d’un masque d’inhalation et d’isoflurane à 2 %. Ensuite, fixez la température corporelle à 36,5 °C à l’aide d’une couverture homéothermique avec retour d’information d’un thermomètre rectal.
4. Après une préparation chirurgicale à la bétadine et à 70 % d’alcool, faites une incision verticale de 1 cm à l’aide d’un scalpel sur le cuir chevelu entre l’oreille gauche et l’œil. Collez l’extrémité distale de la fibre optique d’un débitmètre laser Doppler sur la surface exposée de l’os temporal gauche (1 mm à gauche et 4 mm sous le bregma). Ensuite, démarrez la surveillance de l’écoulement Doppler (Figure 2A).
5. Allongez l’animal. Redressez le cou en tirant sur la dent supérieure avant à l’aide d’une ficelle attachée à une épingle et rasez la zone du cou. Ensuite, faites une incision médiane verticale de 3 cm, écartez-la et exposez la zone du bulbe carotidien gauche en disséquant les tissus mous périvasculaires. Veillez à ne pas blesser le nerf vague.
6. Lister l’artère carotide commune proximale gauche (ACC) à l’aide d’une suture stérile en soie noire 6-0, et ligaturer l’ICA gauche et l’artère ptérygo-palatine gauche (PPA) à l’aide de sutures stériles en soie noire 7-0.
7. Cautériser l’artère thyroïde supérieure gauche, qui est une branche de l’artère carotide externe gauche, à l’aide d’une cautérisation électrique monopolaire, et ligaturer l’artère carotide externe proximale gauche (ECA) de manière lâche et le site le plus distal étroitement à l’aide de sutures stériles en soie noire 7-0.
8. À l’aide d’un micro-ciseau, faites un petit trou (environ 0,2 ~ 0,25 μm de diamètre) entre les sites ligaturés de l’ECA.
9. Insérez le cathéter contenant le thrombus dans le trou de l’ECA tout en desserrant la ligature proximale de l’ECA. Serrez à nouveau la ligature ECA proximale après avoir fait avancer le cathéter dans l’ACC afin de fixer le cathéter en place.
10. Cautériser pour couper la partie distale de l’ECA, qui est distale par rapport au site de ligature distale, et faire pivoter l’ECA proximal libre dans le sens des aiguilles d’une montre pour l’aligner dans la direction de l’ICA tout en retirant le cathéter de l’ACC. Ensuite, avancez le cathéter d’environ 9 mm dans la zone de bifurcation MCA-ACA de l’ICA distal immédiatement après avoir desserré la ligature de l’ICA. Ensuite, resserrez la ligature ICA.
11. Placez le thrombus dans la zone de bifurcation en appuyant doucement sur la seringue de 1 ml pour injecter le thrombus. Vérifiez la diminution du débit sanguin cérébral Doppler (CBF), qui devrait être réduit de 30 % ou moins par rapport à la ligne de base, si le thrombus a réussi à obstruer le vaisseau (Figure 2B).
12. Retirez le cathéter et ligaturez le site proximal de l’ECA immédiatement et fermement. De plus, déligaturez la DPA et le PPA.
13. Fermez le site d’incision à l’aide de sutures en soie 6-0. Arrêtez l’anesthésie après avoir poursuivi la surveillance Doppler pendant la période requise (ici, pendant 30 minutes après l’injection du thrombus). Remettez la souris dans une cage vide et gardez-la au chaud avec une lampe chauffante. Ne laissez pas la souris sans surveillance jusqu’à ce qu’elle ait acquis une conscience suffisante pour maintenir le décubitus sternal.

3. Imagerie MicroCT in vivo du thrombus cérébral (Figure 3)

1. Réanesthésez la souris avec de l’isoflurane à 2 % comme décrit à l’étape 2.1 à un moment prédéterminé (ici, 1 heure) après le début de l’AVC embolique dû au placement du thrombus dans l’artère cérébrale. Assurez-vous d’une profondeur d’anesthésie adéquate en confirmant l’absence de réflexe de pincement de l’orteil. Appliquez une petite quantité de pommade vétérinaire sur chaque œil pour prévenir la sécheresse pendant l’anesthésie.
2. Remettre en suspension des nanoparticules d’or ciblées sur la fibrine (fib-GC-AuNP4) à une concentration de 10 mg Au/ml dans 10 mM de PBS, et sonicer l’agent d’imagerie thrombus pendant 30 min pour assurer la dissolution et la dispersion des nanoparticules. Injecter 300 μl de fib-GC-AuNP (10 mg/ml) dans la veine du pénis.
3. Placez l’animal sur le lit d’un appareil microCT et redressez le cou en tirant sur la dent antérieure supérieure avec une ficelle attachée à une goupille pour réduire les artefacts de mouvement.
4. À 5 minutes après l’injection de fib-GC-AuNP, commencer à obtenir des images micro-CT du cerveau. Pour les expériences décrites ici, utilisez les paramètres d’imagerie suivants : 65 kVp, 60 μA, 26,7 x 26,7 x 27,9 mm³ champ de vision, 0,053 x 0,053 x 0,054 mm³ taille de voxel, 100 millisecondes par image, une moyenne, 360 vues, matrice de reconstruction 512 x 512, 600 coupes, temps de balayage de 64 secondes.
5. Remettez la souris dans une cage vide et gardez-la au chaud avec une lampe chauffante. Ne laissez pas la souris sans surveillance jusqu’à ce qu’elle ait acquis une conscience suffisante pour maintenir le décubitus sternal.
6. Transformez les données d’image brutes au format DICOM (Digital Imaging and Communications in Medicine) à l’aide de la commande « Start » du panneau « Reconstruction » d’un progiciel installé sur le scanner micro-CT.
7. Pour les analyses quantitatives des images (à l’étape 6), transformez les données DICOM au format TIFF à l’aide d’un progiciel disponible dans le commerce selon les instructions du fabricant.
8. Pour des analyses qualitatives ainsi que des analyses quantitatives de manière plus simple et plus rapide, utilisez le progiciel et les images originales de 0,054 mm d’épaisseur au format DICOM pour générer un nouvel ensemble d’images axiales et coronales rendues pour avoir une épaisseur de 1 ou 2 mm (ici, 2 mm), comme suit.
   1. Sélectionnez le dossier DICOM dans l’arborescence 'Source de données', cliquez avec le bouton droit de la souris et importez le dossier dans 'MasterDB' ou 'PrivateDB.'
   2. Cliquez sur 'MasterDB' ou 'PrivateDB' dans l’arborescence 'Source de données', puis sélectionnez le dossier importé. Après avoir cliqué sur l’onglet '3D' sur le panneau le plus à gauche, lorsque la fenêtre 'Options de chargement' apparaît, appuyez sur 'OK' pour importer une séquence d’images dans le dossier sous forme de pile.
   3. Passez au format MIP (Maximum Intensity Projection) en cliquant sur le mot « MRP » dans les fenêtres d’image axiale et coronale, puis en choisissant « MIP » dans le menu contextuel. Ensuite, modifiez l’épaisseur de l’image à 2 mm après avoir cliqué sur 'TH : 0 [mm]' dans la même fenêtre.
   4. À l’aide de la barre de navigation 3D de 2 mm de large qui permet d’explorer une pile d’images et de la découper à un angle et à un emplacement appropriés, préparez une image en coupe axiale de 2 mm d’épaisseur avec une couverture complète du cercle de Willis (COW), qui abrite des thrombus. Cliquez sur le bouton de capture (icône de l’appareil photo) dans le panneau « Sortie ». Enregistrez l’image au format TIFF.
9. Ensuite, préparez cinq images de coupe coronale de 2 mm d’épaisseur qui couvrent de manière contiguë du lobe frontal au cervelet.
   1. Tout d’abord, préparez la deuxième tranche en alignant soigneusement la barre de navigation sur l’image axiale afin que l’image coronale puisse mieux visualiser les thrombus MCA-ACA.

Ensuite, préparez les quatre autres tranches de manière contiguë. Cliquez sur le bouton de capture (icône de l’appareil photo) dans le panneau « Sortie ». Enregistrez les images au format TIFF.

Results

Figure 1 : Vue d’ensemble de la préparation du caillot sanguin marqué par fluorescence. (A) Mélange de sang total frais avec une sonde fluorescente proche infrarouge (NIRF) Cy5.5 (C15) qui est liée de manière covalente aux brins de ...

Materials