Microscopie à deux photons pour la surveillance de la dynamique calcique dans les photorécepteurs coniques rétiniens de souris

Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.

1. Préparation des tranches (10 - 15 min)
   1. Préparez à l’avance des membranes filtrantes en nitrocellulose pour le tranchage de la rétine et des lamelles en verre pour le montage des tranches et leur transfert dans la chambre d’enregistrement. Coupez la membrane filtrante en nitrocellulose en morceaux rectangulaires d’environ 10 x 5 mm à l’aide de ciseaux. Découpez les lamelles en morceaux rectangulaires d’environ 10 x 5 mm à l’aide d’un coupe-verre.
   2. Immergez lentement une lame de verre dans la solution extracellulaire près du tissu. Tirez doucement la tranche rétinienne obtenue à partir de la souris biocapteur HR2.1 :TN-XL Ca²⁺ sur la lame de verre avec la cellule ganglionnaire vers le haut en la saisissant par le bord à l’aide d’une paire de pinces. Ce processus réduit les dommages mécaniques et le pliage des tissus.
   3. Choisissez la région de la rétine qui est liée à la question de recherche respective. Découpez un morceau rectangulaire d’environ 1 x 2 mm dans la région rétinienne sélectionnée à l’aide d’une lame de scalpel incurvée. Essuyez l’excès de solution autour du tissu.
   4. Placez la membrane filtrante sur le morceau de rétine de manière à ce que le côté des cellules ganglionnaires adhère à la membrane. Ajoutez immédiatement une goutte de milieu extracellulaire sur la membrane pour fixer fermement le tissu à la membrane.
   5. Transférez le tissu rétinien monté sur membrane dans la chambre de tranchage contenant une solution extracellulaire fraîche.
   6. Coupez la rétine en tranches verticales de 200 μm d’épaisseur (Figure 1B) à l’aide d’une lame de rasoir fraîche fixée à un hachoir à tissus. Changez la lame pour chaque morceau de rétine.
      Remarque : La lame de rasoir doit être parfaitement alignée avec la surface du fond de la chambre de tranchage de sorte que toute la membrane se fendille simultanément, comme l’indique un son de « clic » lors de la coupe. Sinon, la lame peut se plier et endommager la tranche.
   7. Collez une seule tranche montée sur membrane sur une lamelle de verre en appliquant de la graisse sous vide poussé sur les extrémités de la membrane uniquement (Figure 1C). Gardez la surface du verre sous la rétine exempte de graisse.
   8. Conservez les tranches montées sur lamelles recouvertes d’une goutte de solution extracellulaire dans la chambre de rétention – un récipient fermé et étanche à la lumière, p., une boîte de Pétri dont le couvercle est recouvert d’une feuille d’aluminium et d’aluminium – sous une atmosphère de carboxygène à température ambiante (RT). Introduisez de l’oxygène carbonique en faisant bouillonner un petit réservoir d’eau pour maintenir l’atmosphère de la chambre de rétention humidifiée ; Cela permet d’éviter que les tranches ne se dessèchent.
   9. Laissez reposer les tranches dans la chambre de rétention pendant 10 à 15 minutes avant de les déplacer (une par une) vers la chambre d’enregistrement. Les tranches peuvent être conservées jusqu’à 4 à 5 heures dans une chambre de maintien à RT (~21 °C).

2. Imagerie à deux photons Ca²⁺ Imagerie

1. Microscopie à deux photons
   1. Utilisez un microscope à deux photons de type microscope à objectif mobile (MOM).
      Remarque : Tout microscope droit à deux photons qui remplit les exigences minimales suivantes peut être utilisé : Il doit être équipé de (a) un laser pulsé accordable à ~860 nm, (b) un minimum de deux canaux de fluorescence acquis simultanément, (c) filtres pour la protéine fluorescente cyan améliorée (eCFP) et la fluorescence citrine, (d) un stimulateur de lumière, et (e) un logiciel qui permet d’enregistrer des séquences d’images en accéléré à une fréquence d’images suffisante pour résoudre les signaux d’intérêt Ca²⁺.
   2. Démarrez le système d’imagerie à deux photons comme indiqué par le fabricant. Suivez strictement les directives de sécurité laser de l’établissement. Démarrez le laser et réglez-le sur ~860 nm.
   3. Transférez une tranche de la chambre de rétention à la chambre d’enregistrement et commencez immédiatement à perfuser avec une solution extracellulaire caroxygénée. Maintenir un débit de perfusion de 2 ml/min et une température de 37 °C dans la chambre d’enregistrement.
   4. Utilisez un objectif à immersion dans l’eau à ouverture numérique (NA) 20X 0,95. Si possible, utilisez une caméra CCD (dispositif à couplage de charge) associée à une diode électroluminescente (LED) infrarouge sous la chambre d’enregistrement pour localiser la coupe rétinienne (Figure 2). Sinon, localisez la tranche à l’aide de l’imagerie à deux photons (voir 2.1.5).
   5. Passez à l’imagerie à deux photons pour visualiser l’expression du biocapteur. Activez les deux canaux de détection pour l’imagerie par fluorescence de l’eCFP et de la citrine.
   6. Utilisez le logiciel d’acquisition d’images qui contrôle le microscope à deux photons pour balayer et sélectionner une rangée de bornes coniques pour l’enregistrement (Figure 3A). Réglez l’acquisition d’images sur des images de 128 x 16 pixels (31,25 Hz) ou une configuration similaire. Limitez la zone scannée aux bornes coniques pour éviter de blanchir les photopigments dans les segments externes.
      Remarque : Pour le capteur calcique TN-XL (τ = ~0,6 s pour la liaison Ca²⁺, τ = ~0,2 s pour la liaison Ca²⁺), une fréquence d’images minimale de ~8 Hz est recommandée.
   7. Stimulation lumineuse et enregistrement
      1. Utilisez un stimulateur de lumière plein champ sous-stade pour effectuer les étapes suivantes.
         Remarque : Une solution simple pour un stimulateur de lumière plein champ consiste à utiliser deux LED filtrées par passe-bande (par exemple, « bleue » : 360 passe-bande (BP) 12, « verte » : 578 BP 10) qui correspondent aux sensibilités de longueur d’onde des cônes de souris mais en même temps ne chevauchent pas les filtres utilisés pour la détection de fluorescence. La lumière des LED est focalisée par le condensateur à travers le fond de la chambre d’enregistrement (Figure 2).
      2. Allumez le laser et laissez les cônes s’adapter au laser de balayage et à la lumière de fond du stimulus (20 à 30 sec) avant de présenter des stimuli lumineux (voir 2.2.3) ou d’appliquer des agents pharmacologiques.
      3. Commencer la présentation de stimuli arbitraires ( par exemple, éclairs de lumière, comme le montre Figure 3B, C). Dans le cas du stimulateur décrit à l’étape 2.2.1, générez les stimuli en modulant l’intensité des deux LED au fil du temps à l’aide d’une carte à microprocesseur contrôlée par un logiciel personnalisé.
      4. Commencer l’enregistrement simultané des deux canaux de fluorescence (, par exemple ., à 483 nm pour le « bleu"
   8. Förster à transfert d’énergie de résonance (FRET)-donneur eCFP et à 535 nm pour le donneur FRET « jaune ») simultanément à l’aide du logiciel d’acquisition d’images correspondant (voir aussi 2.1.6). Par exemple, dans le cas de flashs lumineux (Figure 3B, C), enregistrez au moins 8 à 10 présentations de stimulus (essais).

Figure 1. Préparation de coupes rétiniennes verticales. (A) Rétine isolée et aplatie préparée pour le tranchage. (B) Morceau de rétine rectangulaire (voir encadré rouge en A) monté sur une membrane de papier filtre (gris foncé) après tranchage. (C) Vue de dessus de la tranche rétinienne montée sur membrane fixée sur une lamelle de verre à l’aide de graisse. (D) Dessin schématique d’une partie d’une coupe rétinienne (voir encadré rouge en C). Les photorécepteurs coniques sont indiqués en vert. V, ventrale ; D, dorsal ; N, nasillard ; T, temporel ; OS, segment externe ; ONL, couche nucléaire externe ; OPL, couche plexiforme externe ; INL, couche nucléaire interne ; IPL, couche plexiforme interne ; GCL, couche de cellules ganglionnaires.

Figure 2. Imagerie à deux photons de coupes rétiniennes : Illustration de la configuration d’enregistrement. En haut : Lentille d’objectif à immersion dans l’eau focalisant le faisceau du laser à balayage (flèche rouge vers le bas) dans la rétine et recueillant la fluorescence émise (flèches vers le haut). L’objectif recueille également la lumière infrarouge transmise par une LED d’éclairage montée sous le condenseur lors de l’imagerie de la tranche à l’aide d’une caméra CCD. Au centre : Tranche rétinienne montée dans la chambre d’enregistrement et perfusée d’une solution extracellulaire. En bas : Lentille du condensateur focalisant la lumière des LED de stimulation (et de la LED infrarouge pour l’imagerie par caméra CCD) à travers le fond transparent de la chambre d’enregistrement dans le tissu rétinien. LED IR, diode électroluminescente infrarouge ; CCD, dispositif à couplage de charge ; BP, passe-bande.

Figure 3. Réponses Ca2+ évoquées par la lumière dans les terminaisons axonales des photorécepteurs à cône de souris. (A) À gauche : Les enregistrements se sont concentrés sur les terminaisons synaptiques (boîte rouge) des photorécepteurs coniques (vert) dans des coupes rétiniennes. Droite: Exemple d’une région enregistrée avec 7 terminaux individuels. La fluorescence a été enregistrée à l’aide de deux canaux : l’un pour la citrine accepteur FRET (en haut ; 535 BP 50) et l’autre pour l’eCFP donneur FRET (en bas ; 480 BP 32). (B) Changements évoqués par la lumière dans la fluorescence de la citrine (FA) et de l’eCFP (FD) enregistrés en un seul retour sur investissement. (C) Réponses Ca2+ (en rapport F,A/F,D) d’une borne conique à une série de clignotements de lumière vive de 1 seconde à intervalles de 5 secondes. ROI, région d’intérêt ; BP, filtre passe-bande ; F, intensité de fluorescence ; a.u., unités arbitraires ; FRET, transfert d’énergie de résonance de Förster ; eCFP, protéine de fluorescence cyan améliorée. Intensité du stimulus (sous forme de taux de photo-isomérisation dans 103·P·s-1 par cône) : 13,0 et 12,8 pour les Opsines M et S, respectivement, en ajoutant à un niveau de fond (= LED éteintes, balayage laser d’excitation) de ~10.